خالص سازی وتعیین خصوصیات کینتیکی آنزیم آسپاراژیناز در باکتری Serratia Marcescens

آسپاراژیناز یک آنزیم هیدرولاز می باشد که آسپاراژین را به آمونیوم و آسپارتیت تبدیل می کند. این آنزیم کاربرد موثری در درمان لوسمی لنفوبلاستیک دارد. marcescens serratia یک باکتری گرم منفی است که کلنیهای آن دارای رنگیزه قرمز می باشند که می تواند در صورت حضور آسپاراژین در محیط کشت خود، تولید آنزیم آسپاراژیناز نماید. در این تحقیق آنزیم آسپاراژیناز از محیط کشت serratia خالص سازی و همچنین فاکتور های کینتیکی آن تعیین شد. باکتری serratia در محیط مایع حاوی پپتون، عصاره مالت و آسپاراژین کشت شد و محیط بعد از 44 ساعت سانتریفیوژ شد و محلول رویی که دارای آنزیم آسپاراژیناز بود برای مطالعات کینتیکی و خالص سازی مورد استفاده قرار گرفت. مراحل تخلیص آنزیم با استفاده از رسوب دهی با آمونیوم سولفات و به دنبال آن دیالیز و ستون کروماتوگرافی deae سلولز انجام شد. انجام الکتروفورز به روش sdspage باندی با وزن مولکولی تقریبی حدودkda 54 را بر روی ژل نشان داد که نشان دهنده خلوص آنزیم بود. مقایسه تاثیر تغییرات ph (104) بر فعالیت آنزیم نشان داد که بیشترین فعالیت آنزیم در 7 ph است، و بررسی تغییرات دما بر فعالیت آنزیم نشان داد که بیشترین فعالیت در دمای 40 درجه سانتی گراد می باشد. همچنین مقدار فاکتور های کینتیکی vmax و km در این آنزیم مشخص گردید.

Purification and determination of kinetics parameters of asparaginase from Serratia marcescens

Asparaginase is a hydrolytic enzyme that catalyses asparagine to aspartic acid and ammonia. The enzyme is used for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), lymphoma and melanolymphoma. S. marcescens is a Gramnegative bacterium with red pigment that can produce asparaginase in culture medium culture in the presence of asparagine. In this study asparaginase was purified and kinetic parameters of enzyme were determined. A modified culture medium was used for enzyme production containing malt extract, soy peptone and asparagine. Enzyme activity was detected after 8 hours and maximum enzyme activity was reached after 4044 hours of incubation. Purification of the enzyme was carried out using ammonium sulfate precipitation. The concentrated enzyme preparation was loaded onto DEAE cellulose chromatography column. The SDSPAGE was determined a single band with about 54 kDa protein. The optimum pH and temperature of enzyme activity were determined to be about 7 and 40˚C respectively, and the kinetic parameters such as Km and Vmax were measured for the first time in this study.