بهینه سازی شرایط بیان آنزیم کیتیناز42 کایمری در میزبان پروکاریوتی و مقایسه فعالیت آن با آنزیم کیتیناز42

آنزیم های کایمری از جمله پروتئین های مهندسی شده می باشند که از تغییر در ساختار آنزیم ها بدست می آیند. آنزیم های کیتینازی بدلیل توانایی در تجزیه ترکیبات کیتینی، در تولید پروتوپلاست قارچی، تبدیل زیستی shellfish waste به بخش‌های تک جزئی، تولید الیگوساکاریدها و کنترل قارچ های بیماریزا حائز اهمیت میباشند. در این تحقیق پس از تکثیر ناحیه (chitin binding domain) chbd کیتینازb باکتری serratia marcescens و cdna ژن کیتیناز42 قارچ trichoderma atroviride (فاقد chbd) با استفاده از آغازگرهای همپوشان، کیتینازکایمری با استفاده از روش soeing pcr تکثیر و در ناقل بیانی همسانه سازی شد. سازه بیانی نوترکیب حاصل ابتدا به میزبان بیانی پروکاریوتی منتقل و سپس بهینه سازی بیان پروتئین مورد نظر در این میزبان، با استفاده از روش تاگوچی انجام شد. اثر عواملی مانند غلظت iptg، دمای انکوباسیون و مدت زمان انکوباسیون پس از القاء، بر بیان کیتینازکایمری بررسی شد. با توجه به آرایه های متعامد تاگوچی در 3 عامل و 4 سطح، 16 آزمایش طراحی شد. پس از انجام این آزمایش ها پروتئین تام از سلول استخراج و در ژل sdspage مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از sdspage با استفاده از نرم افزار total lab کمی شده و سپس با استفاده از برنامه qualitek4 تجزیه وتحلیل شد. نتایج حاصل نشان داد که در بین عوامل مختلف، غلظت iptg بیشترین اثر را بر بیان پروتئین کیتینازکایمری دارد. بهترین شرایط بیان برای پروتئین کیتینازکایمری به ترتیب iptg با غلظت یک میلی مولار، دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت بدست آمد.

Optimization of chimeric chitinase42 prokaryotic expression and comparison of its chitinase activity with Chit42

Chitinases have the ability of chitin digestion that constitutes a main compound of the fungal cell wall, insect exoskeletons, and crustacean shells. Chitinase Chit42 from Trichoderma atroviride PTCC5220 is considered to play an important role in the biocontrol activity of this fungus against phytopathogenic fungi. The ChitinBinding Domain (ChBD) of Serratia marcescens chitinase B was selected and fused to the fungal chitinase, T. atroviride Chit42 using SOEing PCR with overlapping primers. The chimeric fragment was cloned into prokaryotic expression vector (pET26b+) and transformed to E. coli BL21DE3. Culture conditions for chimeric enzyme production by E. coli were optimized by Taguchi orthogonal array experimental design methodology. This approach facilitates the study of interaction of a large number of variables spanned by factors and their settings with a small number of experiments leading to considerable saving in time and cost for the process optimization. The objective of the current research was to determine the significant parameters on the production of chimeric chitinase enzyme in the culture. The process variables were IPTG concentration, incubation time, and temperature. The total protein extraction of all experiments were carried out and analyzed by SDSPAGE, Total lab and Qualitek4 software. The optimal levels of the different factors for chimeric chitinase production were 1mM IPTG, and 16 hours of incubation time at 28 C. IPTG concentration was the most important factor in the enzyme production.