بیان هترولوگ آنزیم کیتیناز 36 کیلو دالتونی از قارچ Trichoderma Atroviride در میزبان پروکاریوتی

آنزیم‌های کیتینولیتیک در تجزیه پسماندهای کیتینی نظیر پوسته سخت‌پوستان و دیواره سلولی قارچ‌ها و تولید الیگوساکاریدها از کیتین نقش دارند. خصوصیات کاتالیتیک آنها، این آنزیم‌ها را هدف مناسبی جهت استفاده درصنعت یا به عنوان بیوکنترل قرار داده‌ است. در این مطالعه جهت تکثیر و همسانه‌سازی ژن chit36 از جدایه بومی ایران trichoderma atroviride ptcc5220، آغازگرهای اختصاصی (chit36pf/chi36r) طراحی و پس از تکثیر قطعه مورد نظر، به منظور تولید پری‌پلاسمی در وکتور pet26b(+) همسانه‌سازی و جهت بیان به باکتری e. coli bl21de3 انتقال داده شد. در بررسی نتایج حاصل از sdspage هیچگونه باندی دال بر بیان پروتئین در هیچکدام از شرایط دمایی و میزان متفاوت iptg در بخش‌های متفاوت سلولی مشاهده نشد. لذا در ادامه، بیان پروتئین chit36 با حذف پپتید نشانه pelb (جهت تولید به صورت سیتوپلاسمی) همراه با توالی هیستیدین در انتهای کربوکسیلی دردستور کار قرارگرفت. باکتری حاوی سازه نوترکیب تحت شرایط القایی متفاوت مورد بررسی قرار گرفت. علیرغم عدم مشاهده هیچگونه باندی در هیچکدام از شرایط القایی با روش sdspage، بیان اندک پروتئین در 2 کلنی با استفاده از روش western blot مورد تایید قرار گرفت. به منظور بهینه سازی شرایط بیان، میزان بیان پروتئین نوترکیب نسبت به پروتئین تام باکتری درشرایط متفاوت القایی، به روش سنجش کمی باند های پروتئینی روی ژل sdspage مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصله نشان داد که بهترین شرایط بیان در زمان القا od600 : 0.3 و میزان iptg یک میلی‌مولار و زمان انکوباسیون 6 ساعت می‌باشد، دراین شرایط میزان بیان پروتئین نوترکیب نسبت به پروتئین تام برابر %57/ 45 می‌باشد.

Heterologous expression of Chit36 from Trichoderma atroviride in prokaryotic system

Chitinolytic enzymes are involved to break down chitin waste products such as chitin shells of crustaceans and cell walls of fungi and production of chitin oligosaccharides. Ideal catalytic properties of these enzymes make them an attractive target for use in industry or as a biocontrol. In this study to amplify and cloning of chit36 gene from native Iranian isolate, Trichoderma atroviride PTCC5220, Specific primers (chit36pf/chi36r) were designed and then intended to produce in periplasmic form, amplified fragment was cloned into pET26b(+) vector. The new construct was transformed into E. coli BL21DE3 bacteria. The results of SDSPAGE showed no evidence of protein expression in any of the conditions of temperature and different levels of IPTG at different cell fractions. So expression of Chit36 protein with the removal of signal peptide (to produce cytoplasmic form) with histidine sequence at the carboxyl end was planned. Bacteria containing recombinant construct were evaluated at different induction conditions. Despite detection of any band in any induction conditions using SDSPAGE, low expression of proteins in two colonies were confirmed by Western blot assay. In order to optimize the expression condition, recombinant protein expression levels relative to the total bacterial protein in different induction conditions was evaluated using the quantitative measurements of protein bands on SDSPAGE gels. The results showed that the best condition to induce expression is at OD600 : 0.3 and 1 mM IPTG and incubation time of 6 hours. In these conditions expression level of recombinant protein relative to total protein was 45.57%.