ارزریابی عملکرد دو پپتید نشانه از گیاهان اطلسی ((petunia × hybrida) و اسفناج (spinacia oleracea) به منظورانتقال پروتئین های نوترکیب به اندامک کلروپلاست

بمنظور انتقال پروتئین‌های نوترکیب به کلروپلاست در جهت عملکرد مناسب و یا ذخیره سازی آنها در این اندامک، می‌توان از توالی‌های پپتید نشانه مناسب بهره جست. در این مطالعه، در دو مرحله آنالیزهای بیوانفورماتیکی و سپس آزمایشگاهی، با هدف انتخاب پپتیدهای نشانه مناسب کلروپلاستی، ارزیابی روی توالی‌های مختلف انجام گرفت. بدین منظور ابتدا 160 پپتید نشانه از ژن‌ها و میزبان‌های مختلف جهت بررسی جایگاه برش، احتمال انتقال به کلروپلاست و بررسی آب‌گریزی آن‌ها مورد آنالیز بیوانفورماتیکی از جمله targetp ، tppred ، predsl و  protoscale  قرار گرفتند. ساختارهای ثانویه مربوط به رونوشت های آنها به در حالت اتصال به ژن گزارشگر نیز پیش بینی شدند. در ادامه، پپتیدهای نشانه ژن epsps از گیاه اطلسی (petunia × hybrida) و نیز ژن pcad از گیاه اسفناج (spinacia oleracea) با طراحی آغازگرهای اختصاصی و انجام pcr از ژنوم آنها جداسازی و به توالی ژن گزارش‌گر gus متصل شدند. انتقال سازه‌ها به آگروباکتریوم تومفاشینس برای تراریختی گیاه مدل توتون (nicotiana tabacum) صورت گرفت. پس از تراریختی و باززایی گیاهان تراریخت، سنجش کیفی و کمی β-glucuronidaseبه ترتیب به روش های رنگ آمیزی هیستوشیمیایی و فلوریمتری بر روی کلروپلاست‌های جداشده از برگ‌های سبز و جوان نشان داد که محصول ژن gus با موفقیت به کلروپلاست‌های گیاه هدفمند شده است و پپتید نشانه ژن epsps کارایی بالاتری را در انتقال پروتئین نوترکیب به کلروپلاست‌ها داشته است. توالی مذکور می‌تواند کاندیدی برای استفاده در گیاهان تراریخته تجاری در راستای هدفمندی محصول پروتئینی در ساختارهای پلاستیدی و نهایتاً افزایش بروز صفت موردنظر و یا ذخیره‌سازی و خالص‌سازی بهتر محصولات پروتئینی باشد.

functional study of two signal peptides derived from petunia (petunia × hybrida) and spinach (spinacia oleracea) in order to transfer recombinant proteins to chloroplast

signal peptides can be used to effectively transfer recombinant proteins into chloroplast for their appropriate functionality or storage. in this study, the efficiency of candidate signal peptides was studied using in silico and in vitro approaches. at first, the cleavage sites, ability to transport into chloroplast, and hydrophobicity of 160 signal peptides were analyzed by bioinformatic tools such as targetp, tppred, predsl, and protoscale. the secondary structures of the transcripts of reporter gene fused to these signal peptides were also predicted. in the next step, signal peptides of epsps and pcad genes respectively from petunia (petunia × hybrida) and spinach (spinacia oleracea) were cloned using specific primers. β-glucuronidase gene and each signal peptides coding sequences were fused together. the resulting fragments were then transferred by agrobacterium tumefaciens and over-expressed in tobacco (nicotiana tabacum) as a model plant. chloroplasts were extracted from transgenic young and green leaves and β-glucuronidase activity was assayed qualitatively by histochemical and quantitatively by fluorometric methods. the results showed that gus was present and active in chloroplasts and the epsps signal peptide was more effective than pcad in transferring the target protein. in conclusion, we can speculate that the identified signal sequences have the potential to transfer recombinant proteins into plastids for more effectiveness or for storage and extraction purposes.