افزایش پایداری دمایی پروتئاز سالینی ویبریو پروتئولیتیکوس af 2004 با استفاده از جهش زایی هدفمند مکانی

روش‌های جهش‌زایی هدفمند مکانی، یکی از موثرترین روش‌ها در بهبود فعالیت و پایداری آنزیم‌های صنعتی است. در مطالعه حاضر، اثر جایگزینی آمینواسید آلانین 56 به ایزولوسین، بر پایداری دمائی متالوپروتئاز تولید شده توسط یک باکتری نسبتا هالوفیل به نام سالینی‌ویبریو پروتئولیتیکوس بررسی شد. به منظور تهیه سویه جهش یافته مورد نظر، از پرایمرهای جهش‌زا (موتاژنیک) و سپس تیمار با آنزیم محدود الاثر dpn i استفاده شد. ژن جهش یافته حاصله در سازه بیانی pqe80l، به سویه‌های بیانی مختلف اشریشیا کلای (مانند سویه‌های xl1 blue، bl21(de3) plyss و top10) ترنس‌فورم شد. سپس بیان آنزیم نوترکیب تحت شرایط مختلف کشت، بهینه‌سازی گردید. آنزیم جهش یافته و آنزیم طبیعی، از ژل زیموگرافی استخراج شدند. در نهایت، پایداری دمائی و فعالیت آنزیم جهش یافته و آنزیم طبیعی، بررسی شد. حداکثر میزان بیان آنزیم، با استفاده از سویه میزبانی e.coli bl21 (de3) plyss ، در محیط‌کشت terrificبراث، در حضور iptg 1 میلی مولار و بعد از 24 ساعت انکوباسیون در دمای°c37، به دست آمد. آنزیم طبیعی و جهش یافته، به ترتیب حدود 42 و 24 درصد از فعالیت خود را بعد از انکوباسیون در دمای °c70 به مدت 20 دقیقه از دست دادند. از طرفی، فعالیت آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی، حدود 11 درصد بیشتر بود. بنابراین، فعالیت و پایداری دمائی متالوپروتئاز باکتری سالینی‌ویبریو پروتئولیتیکوس جهش یافته (جایگزینی آلانین 56 به ایزولوسین) نسبت به آنزیم طبیعی بهبود یافت.

enhancement of salinivibrio proteolyticus strain af 2004 protease thermostability using site directed mutagenesis

abstract: site directed mutagenesis is one of the most effective methods for enhancing the activity and stability of industrial enzymes. in this study, the influence of alanine 56 substitution to isoleucine on the thermostability of a metalloprotease produced by a moderately halophilic bacterium named salinivibrio proteolyticus (svp) strain af 2004 was investigated. the given mutation was constructed using the mutagenic primers and dpni restriction enzyme treatment. the resulted mutant gene in the pqe 80l vector was transformed into the various expression strains of escherichia coli (xl1 blue، bl21 (de3) plyss, and top10). then, the enzyme expression was optimized using different cultural conditions. subsequently, the wild and mutant enzymes were extracted from zymography gel. finally, the thermostability and activity of wild and mutant enzymes were assayed. the maximum expression of the enzyme was achieved using e.coli bl21 (de3) plyss, in terrific broth medium, in the presence of 1 mm iptg, and after 24 h induction at 37 ºc. the extracted wild and mutant enzymes lost 42 and 24 percent of their activity after incubation at 70 ºc for 20 min, respectively. however, the activity of the mutant enzyme was 11 percent more than the wild enzyme. therefore, the activity and thermostability of the mutant svp metalloprotease (a56i) were improved compared to the wild enzyme.