بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی زبرا به عنوان مدل تحقیقاتی انتقال ژن در آبزیان پرورشی

جهت ایجاد ماهی رنگی زینتی زبرا، واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) با استفاده از آغازگرهای طراحی شده برای پیشبر دو ژن انتخاب شده در سلول های عضلاتی و همسانه سازی این قطعات ژنی در وکتور tol2 که خود حاوی ژن پروتئین فلوئورسنت سبز (gfp) بود در ناحیه خوانش باز (orf) صورت گرفت. به ترتیب قطعات 2000 و 2300 جفت بازیِ ناحیه پیشبر ژن های mylz2 و ckmb بوسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر شده، در وکتور بیانی tol2 دارای جایگاه برشی آنزیم sali همسانه سازی شد و به باکتری اشریشیاکلی (e. coli) سویه dh5α انتقال یافت. همسانه های مثبت توسط colony pcr با استفاده از آغازگرها مورد بررسی قرار گرفت و برای استخراج پلاسمید نوترکیب کشت شد. پلاسمید نوترکیب استخراج شده توسط هضم آنزیمی sali بررسی شد و به کمک آغازگرهای عمومی تعیین توالی گردیدند. در این مطالعه، به ترتیب قطعات 2000 و 2300 جفت بازیِ راه انداز ژن های mylz2 و ckmb در وکتور بیانی tol2 همسانه سازی شدند که تایید آن با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز، توالی یابی و هضم آنزیمی صورت گرفت. همچنین، پلاسمید نوترکیب کشت داده شد و برای تزریق به همراه یک رونوشت سنتتیک خالص سازی گردید. جنین های تک سلولی تزریق شده (توسط پلاسمید نوترکیب و رونوشت) به وسیله میکروسکوپ فلوئورسنس برای بررسی بیان gfp آزمایش شدند و مشخص شد که بیان gfp در سلول های عضلانی برخی از نتاج نسل f0 روی داده است. پلاسمیدهای نوترکیب شده با استفاده از پیشبرهای مختص سلول های عضلانی (mylz2 و ckmb) قادر به القاء بیان gfp در برخی از جنین های نسل f0 به صورت موقت بودند و از این رو می توانند جهت تثبیت بیان در نسل های بعدی ماهی استفاده شوند.

Gene transfer biotechnology in zebrafish as a gene transfer research model in farmed aquatic animals

The polymerase chain reaction (PCR) was applied to create the colored transgenic ornamental zebrafish with the specific primers designed for muscle promoter of two genes and genes fragments cloned in Tol2 vector containing GFP gene in the ORF region. The 2000 bp and 2300 bp fragments of MYLZ2 and CKMB promoters’ genes respectively were amplified by PCR, cloned into Tol2 plasmid expression vector containing SalI restriction enzyme site and transformed into E. coli Dh5α. Positive clones were tested for having fragments by colony PCR with anchor primers and subcultured for extracting recombinant plasmid miniprep. The extracted recombinant plasmid was tested with SalI enzyme digestion and sequenced with universal primers. Positive recombinant plasmids were applied for injection with transcript produced synthetically in the lab into zebrafish onecell embryo. In this study, 2000 bp and 2300 bp fragments of MYLZ2 and CKMB promoters, respectively, were cloned in an expression vector Tol2 and confirmed by PCR, sequencing and enzymatic digestion. Also, recombinant plasmid was subcultured and purified for injection with a synthetic transcript. Onecell embryos injected by coinjection materials (recombinant plasmid and transcript) were tested by fluorescence microscope for positive GFP expression, where a few offspring of F0 generation were positive for GFP expression in their muscles. Recombinant plasmids with musclespecific promoters (MYLZ2 and CKMB) were able to induce expression of GFP in some F0 embryos in a transient form and could be applied for consolidation in the next fish generation.