بررسی پایداری بیان پروتئین غشای سطحی Lipl41به صورت فیوژن با پروتئین کوچک چاپرون Lepدر لپتوسپیرا

زمینه و هدف: لپتوسپیروزیس یک بیماری باکتریایی مشترک بین انسان و دام با انتشار جهانی می‌باشد که توسط اسپیروکت بیماریزایی به نام لپتوسپیرا ایجاد می‌گردد. متاسفانه تشخیص این بیماری بدلیل علائم متعدد بالینی بسیار مشکل و دارای محدودیت است. lipl41یکی از فراوان ترین پروتئین های غشای خارجی لپتوسپیرا ست که فقط در سویه های بیماریزا وجود دارد. ژن کوچکی بنام lepدر فاصله بسیار نزدیک با ژن lipl41بر روی کروموزوم باکتری قرار دارد که کمک کننده بیان آن می‌باشد. در این مطالعه برای اولین بار بررسی بیان و تخلیص پروتئین فیوژن lipl41lep بر روی سویه های بومی رایج لپتوسپیرای بیماریزا در سیستم پروکاریوتی صورت گرفت. مواد و روش ها: توالی ژنی بر مبنای الگوی سرووارهای ایران پس از جمع آوری کلیه اطلاعات موجود در سایتncbi طراحی و ساخته شد. سپس با کلونینگ در وکتوربیانی pet32a+ درe.colibl21(de3) انتقال و توسط القاء کننده iptg بیان انجام شد. پس از لیز سلولی با روش دناتوراسیون خالص سازی صورت گرفت. روش وسترن بلات برای تایید حضور پروتئین فیوژن نوترکیب استفاده گردید. یافته‌ها :نتایج آنالیز pcr وجود باند واضح حدود2000جفت باز را روی ژل آگارز تایید کرد. مقادیر زیادی از پروتئین فیوژن نوترکیب60 کیلودالتونی در دمای ˚c37‌‌، با غلظت mm0.1 از iptg و زمان 4 ساعت پس از القا به صورت نامحلول تولید، استخراج و خالص سازی شد.نتیجه گیری:یافته‌ها نشانگر مقدار کافی از بیان و تخلیص این پروتئین نوترکیب بصورت فیوژن بود. بنابراین از آن می‌توان در آینده بعنوان کاندیدای مناسبی در جهت تستهای تشخیص سرولوژیک مانند الایزا و همچنین برای واکسن های نوترکیب بر علیه لپتوسپیروز استفاده شود.

The Evaluation of the Stability of Lipl41 Outer Membrane Protein Expression in Fusion with Lep, a Small Chaperone Protein, inLeptospira

Aim and objective:Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic spirochete called Leptospira that has worldwide distribution. Unfortunately, due to the variety of clinical symptoms, its diagnosis has many limitations. LipL41 is among the most abundant outer membrane proteins in Leptospira and is exclusively found in pathogenic species. A small gene called lep is located very close to lipl41 gene on the bacterial chromosome, which facilitates its expression. In this study, the expression and purification of LipL41Lep fusion protein among prevalent pathogenic isolates in Iran was performed in a prokaryotic system for the first time. Methods:All collected Lipl41 and Lep protein sequences were analyzed from the NCBI database. Complete codon sequences of the pattern of the Iranian serovars were designed and synthesized then subcloned into a pET32a+ and transformed into Escherichia coli BL21(DE3) to expression by using IPTG inducer. Thefusion recombinant protein was purified by denaturation and confirmed by western blot.Results:The results of PCR analysis showed a clear band of ~ 2000 bp in Agarose gel.Optimal expression of fusion recombinant protein (60kDa) was achieved postinduction at 4 h at 37 °C in the presence of 0.1 mM IPTG. Then it was purified in the insoluble form.Conclusion:The results demonstrated that adequate amounts of this fusion recombinant protein were expressed andpurified to be used as a fusion antigen in serological testing, such as ELISA, or for the development of subunit vaccines against Leptospirosis in the future.