جداسازی و کلونینگ ژن پروتئین سطحی (Psp) استرپتوکوک پنومونیه در باکتری اشریشیاکلی Dh5 آلفا جهت دستیابی به واکسن

زمینه و هدف: استرپتوکوک پنومونیه یا پنوموکوک، دیپلوکوک گرم مثبت به قطر 5/0 تا 2/1 میکرومتر، آلفا همولیتیک و تحمل‌کننده اکسیژن از جنس استرپتوکوکوس و عامل بیماریهایی چون مننژیت و ذات الریه می‌باشد.باکتری حامل ژن پروتئین سطحی pneumococcal a (pspc)از s بوده و هدفی امیدوارکننده برای فرمولاسیون های واکسن جدید است. به همین جهت هدف از انجام این تحقیق جداسازی و کلونینگ ژن پروتئین سطحی (psp) استرپتوکوک پنومونیه در باکتری اشرشیاکلی dh5 آلفا به منظور تهیه واکسن برای کودکان می‌باشد.مواد و روش‌ها: نمونه‌ها از تعداد 100 کودک سالم، در مهد کودک های شهر اراک به طور تصادفی از نازوفارنژیال کودکان سالم زیر 6 سال بود که در مجموع 12 ایزوله پنوموکوک جداسازی شد. به منظور جداسازی و شناسایی اولیه استرپتوکوک پنومونیه از محیط کشت و آزمون های بیوشیمیایی استفاده شد و استخراج dna صورت گرفت. از طریق آزمون pcr سویه های واجد ژن pspc شناسایی شد. ژن pspc سویه های مثبت از طریق وکتور به باکتری میزبان اشرشیاکلی الحاق و از طریق تکنیک ta کلونینگ کلون شدند و در پایان از طریق تکنیک real time pcr میزان بیان ژن‌ها در اشرشیا کلی dh5 آلفا سنجیده و برای رسم درخت فیلوژنی از نرم‌افزار clustalx و mega5 استفاده شد. یافته ها: از غربالگری نمونه های بالینی ارسالی به آزمایشگاه که براساس خصوصیات مورفولوژیک، میکروسکوپی و تست های بیوشیمیایی تعیین هویت شدند در مجموع 12 ایزوله پنوموکوک جداسازی شد. و از این تعداد 1 ایزوله دارای ژن pspc بود. پس از کلونینگ، ژن های pspc، سویه های کلون شده کلنی سلکشن (آبی/سفید) جداسازی شدند. به منظور تایید نتایج کلونینگ dna , از کلنی های مشکوک استخراج و توسط آزمون real time pcr گردید. در نهایت تصاویر سکانسینگ‌، m13 و منحنی تکثیر، بیان ژن در باکتری اشریشیاکلی dh5 alpha; را تایید کرد. نتیجه گیری: در این مطالعه با ارزیابی ژنومی پنوموکوک جدا شده از کودکان زیر 6 سال‌، ژن pspc با پتانسیل ایمن سازی و به منظور ساخت واکسن از این باکتری استخراج گردید و کلونینگ با موفقیت صورت گرفت. در نهایت با بررسی درخت فیلوژنی رسم شده در این مطالعه میزان تشابه و خویشاوندی گونه استرپتوکوک پنومونیه با سایر گونه‌ها نشان داده شد.

Isolation and Cloning of Streptococcus Pneumoniae Surface Protein (PSP) gene in Escherichia Coli DH5 Alpha to Obtain Vaccine

Background and Aim: Streptococcus pneumoniae or pneumococcus, grampositive diplococcus with a diameter of 0.5 to 1.2 mu;m, alpha hemolytic and oxygen tolerant of Streptococcus and causes diseases such as meningitis and pneumonia. The bacterium carries the Pneumococcal A surface protein gene (PspA) from S, and several studies show that PspA is a very promising target for new vaccine formulations. Therefore, the aim of this study was to isolate and clone the Streptococcus pneumoniae surface protein (psp) gene in Escherichia coli DH5 alpha; in order to provide a vaccine for children.Methods: Sampling of a total of 60 pneumococcal isolates was isolated from nasopharyngeal samples of healthy children under 6 years of age. In order to isolate and initially identify Streptococcus pneumoniae, culture medium and biochemical tests were used and DNA extraction was performed. Then, strains with pspC gene were identified by PCR. The pspC gene of the positive strains was transfected into Escherichia coli host bacteria by vector and cloned by TA cloning technique. Finally, the expression of genes in Escherichia coli DH5 alpha; was measured by Real time PCR technique. ClustalX and Mega5 software were used to draw the phylogenetic tree.Results: A total of 12 pneumococcal isolates were isolated from the screening of clinical specimens sent to the laboratory, which were identified based on morphological, microscopic and biochemical characteristics. Of these, 1 isolate had pspC gene. After cloning, pspC genes were isolated from cloned selection colonies (blue / white). In order to confirm the results of DNA cloning, it was extracted from suspected colonies and PCR by real time test. Finally, sequencing images, m13 and proliferation curves, and confirmed gene expression in Escherichia coli DH5 alpha;.Conclusion: In this study, by genomic evaluation of pneumococci isolated from children under 6 years of age, pspC gene with immunization potential was extracted from this bacterium in order to make a vaccine. And cloning was successful. Finally, by examining the phylogenetic tree drawn in this study, the degree of similarity and kinship of Streptococcus pneumoniae with other species was shown.