ترنسداکشن پایدار ترنسژن gfp در سلول سخت ترنسفکت ماکروفاژ موشی raw264.7 با استفاده از وکتورهای نسل دوم لنتی ویروس

سلولهای ماکروفاژی، دسته ای از سلولهای سخت‌ترنسفکت می باشند که بدلیل اهمیت هدفگیری آنها در استراتژیهای درمانی، پیاده سازی یک روش موفق ترنسفکشن در آنها همواره مدنظر می‌باشد. کارایی وکتورهای لنتی ویروسی در مقایسه با سه ترکیب تجاری xfect™ transfection reagent، fugene® hd و lipofectamine tm 3000 در ترنسفکشن سلول ماکروفاژی raw264.7 بررسی گردید. بعد از بهینه سازی و تولید ذرات ویروسی در سلول 293t، آلوده سازی سلولی با moiهای متفاوت صورت گرفت و میزان کارایی ترنسداکشن، زنده مانی و فعالیت متابولیک سلولها اندازه گیری و با روشهای شیمیایی مقایسه گردید. هیچیک از سه ترکیب شیمیایی تجاری قادر به ترنسفکت موفق raw264.7 نشدند در حالیکه روش ویروسی در کمترین غلظت نیز قادر به ترنسداکشن سلولها و ایجاد سیگنال سبز رنگ در زیر میکروسکوپ فلورسنت گردید. تغلیظ استوک ویروسی و بکارگیری moiهای بیشتر تا 30 بطور معنی‌داری (p≤0.0001) باعث افزایش راندمان ترنسداکشن گردید. روش ترنسفکشن لنتی‌ویروسی علی رغم کار زیاد و زمان طولانی تر در مقایسه با روشهای شیمیایی جهت ترنسفکشن سلولهای سخت‌ترنسفکت کارایی بالاتری دارد که در این تحقیق انجام برخی اصلاحات نظیر تغلیظ ویروس، عدم فریز ویروسها، استفاده از پلی‌برن و انکوباسیون شبانه سلولها با ذرات ویروسی کارایی آنرا افزایش داد. از آنجا که پارامترهای مهم دیگری مانند استفاده از رترونکتین و سانتریفوژ چند ساعته ویروس و سلول در کنار هم (اسپینوکولیشن)، بر روی فرایند آلوده‌سازی ویروسها بسیار موثرند، پیشنهاد می‌شود در مطالعات بعدی مدنظر قرارگرفته و با توجه به داده‌های امیدوارکننده این تحقیق، از این روش تکمیلی برای ترنسداکشن دیگر سلول‌های سخت‌ترنسفکت مانند سلول‌های بنیادی یا سلول‌های اولیه نیز استفاده شود.

stable gfp transduction of hard-to-transfect mouse macrophage raw264.7 cells by a second-generation lentiviral vector

introduction: macrophages are considered a particularly challenging cell type to transfect. given their importance as therapeutic targets, developing a successful transfection method for these cells is highly desirable.materials and methods: the efficiency of lentiviral transfection was compared to three commercially transfection reagents (xfect™ transfection reagent, fugene® hd, and lipofectamine tm 3000) in raw264.7 macrophage cells. following optimization and production of lentiviral particles in 293t cells, raw264.7 cells were infected with varying moi. transduction efficiency, cell viability, and metabolic activity were measured and compared to the transfection efficiency of the chemical methods.results: none of the three chemical transfection reagents successfully transfected raw264.7 cells. in contrast, the lentiviral method achieved transduction even at the lowest concentration of viral stock, with a green fluorescent signal observable under a fluorescence microscope. increasing the viral stock concentration and using higher mois (up to 30) significantly (p≤0.0001) increased transduction efficiency.discussion: despite requiring more time and effort than chemical methods, lentiviral transduction exhibited superior efficiency in transfecting hard-to-transfect cells and further improvements were achieved through some modifications such as virus concentration, the use of polybrene, no viral freezing and o/n incubation with concentrated viral particles. since other parameters, especially the use of retronectin and spinoculation, are effective on the efficiency of the virus infection process, it is suggested that they be considered in future studies and given the encouraging data of this research, this completed method can also be applied to other difficult-to-transfect cells, such as different types of stem cells or primary cells.