بیان آنتی‌ بادی تک دمینی ضد vegf انسانی از طریق نمایش سطحی در e. coli با استفاده از‌ دمین انتهای آمین پروتئین هسته ‌زایی یخ (inp)

آنژیوژنز در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیک و پاتولوژیک از جمله رشد تومور دخالت دارد و vegf مهم ترین فاکتور در این فرایند محسوب می شود. امروزه تولید آنتی بادی های تک دمینی (vhh) با ویژگی مهار فاکتورهای رشد در تومورهای سرطانی یکی از راهکار های جدید درمان سرطان می باشد. در پژوهش قبلی ما مشخص شد vhhهای شتری تهیه شده با استفاده از نمایش فاژی علیه vegf در مهار آن نقش اساسی ایفا می کند. در این بین vhhی که دارای بیشترین تمایل به جایگاه اتصال به vegf در بین دیگر اعضا کتاب خانه فاژیvhh ها تهیه شده بود، انتخاب شد. با توجه به کارایی بیان سطحی e. coli با استفاده از موتیف لنگری پروتئین هسته‏زایی یخ (inp)، از این سیستم برای بیان پروتئین استفاده شد. از آنجا که در اتصال inp به سطح سلول فقط دمین انتهای آمینی نقش دارد، در طراحی سازه ژنی از 537 جفت باز ابتدایی ژن inak استفاده شد. همچنین با قراردادن جایگاه برش آنزیم پروتئاز tev بین inp وvevhh10، امکان جداسازی موفقیت آمیز vevhh10 از سطح سلول باکتری فراهم گردید. بیان سطحی با استفاده از پلاسمید pet-21a حاوی inp و vevhh10علیه vegf انجام شد. نتایج نشان داد دنباله inpگزینه مناسبی برای بیان سطحی vevhh10در e. coli می باشد. پس از تولیدvevhh10 نوترکیب، جداسازی و تخلیص با استفاده از سانتریفیوژ و شستشوی متعدد انجام گرفته و اتصال آن به vegf مورد بررسی قرار گرفت. اتصال موفقیت آمیزvevhh10 به vegf نشان داد که پروتئین نوترکیب حاصل می تواند برای کاربردهای درمانی و تشخیص بالینی بیماران در آینده استفاده شود.

cell-surface displayed expression of single domain antibody against vegf in e. coli using n-terminal domain of ice nucleation protein (inp)

angiogenesis is involved in many physiological and pathological processes, including tumor growth, and vegf is considered as the most important factor in this process. nowadays, the production of single-domain antibodies (vhh) with the characteristic of inhibiting growth factors in cancer tumors is one of the new strategies for cancer treatment. in the previous research, it was found that camel vhhs isolated from phage display against vegf play an essential role in inhibiting it. here, the vhh that had the highest affinity for the vegf was selected. ice nucleation protein (inp) was used as anchoring motif for surface expression of e. coli, owing to the efficiency of its n terminal domain, this system is used to express the vhh. accordingly, a construct harboring the first 537 nucleotide of inak gene and nucleotide fragments of tev protease recognition site and vevhh10 was designed to express this protein in the surface display of e. coli cells. the results showed that the inp anchor is a suitable candidate for promoting the surface expression of vevhh10 in e. coli. after expression of vevhh10, isolation and purification were performed using centrifugation and washing, and its binding to vegf was investigated. the results showed that vevhh10 successful bind to vegf and it can be used for therapeutic applications and clinical diagnosis of patients in the future.