غربالگری و شناسایی باکتری ‌های تجزیه کننده سلولز از خاک و کلون سازی ژن مربوط به آنزیم اندوگلوکاناز

در سال های اخیر استفاده از بیوکاتالیست‌ها در صنعت اهمیت فراوانی دارد. چون آنها واکنش‌های شیمیایی را با صرف کمترین انرژی و بالاترین بازده انجام می‌دهند. در این بین آنزیم‌های باکتریایی با توجه به روش آسان کلون‌سازی و بیان بالای پرتئین‌ها در میزبان قابل دستورزی اهمیت خاصی دارند. آنزیم سلولاز فراوانترین پلیمر موجود در طبیعت را به واحدهای گلوکز هیدرولیز می‌کند. ‌گلوکز تولید شده از این روش می‌تواند کاربردهای متنوع داشته باشد از جمله تولید سوخت زیستی، شیرین کننده در صنایع غذایی و تولید اتانول. با توجه به کاربرد گسترده این آنزیم، در سال‌های اخیر کلون‌سازی و تولید آن در میزبان‌های دستورزی شده گسترش یافته است. این مطالعه به منظور جداسازی، غربالگری و شناسایی سویه‌های بومی تولید کننده آنزیم اندوگلوکاناز از نمونه‌های خاک اطراف ریشه درخت افرا در منطقه شمال کشور انجام شد. سویه‌های جدا شده با استفاده از توالی یابی ژن 16s rrna شناسایی شدند. پس از شناسایی نوع باکتری(enterobacter hormaechei) ، تکثیر ژن آنزیم اندوگلوکاناز ابتدا توسط آغازگرهای دژنره و سپس توسط آغازگرهای اختصاصی دارای توالی‌های برشی انجام شد و الحاق ژن در پلاسمید مناسب با استفاده از آنزیم‌های برشی و الحاقی مناسب صورت گرفت. سپس پلاسمید نوترکیب حاصل به میزبان e.coli bl-21 ‌منتقل شد و بیان پروتئین هدف با تحریک اوپران لک در غلظت mm 1 iptg انجام گرفت. ثابت‌های کینتیکی آنزیم از جمله vmax و km به ترتیب برابر با 45 میکرومول در دقیقه و 1/4 میلی‌گرم در میلی لیتر محاسبه گردید. بهینه شرایط فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شده در دمای 37 درجه سانتی گراد و ph 7 می‌باشد.

screening and identification of native cellulose-degrading bacteria from soil and cloning of endoglucanase enzyme gene

in recent years, biocatalysts have widespread application in industry because they can do chemical reactions with the lowest energy and highest efficiency. bacterial enzymes are more useful in this field due to simple cloning and expression process in the manipulated host. by considering specific role of endoglucanase enzymes in cellulose hydrolyzing reactions, these types of enzymes are more applicable in related industries. the produced glucose through enzymatic hydrolysis could be used in different industries such as biofuel and ethanol production and in the food industry as sweetener. therefore, cloning and production of endoglucanase in manipulated hosts has been developed in recent years. this study was performed to isolate, screen and identify native endoglucanase -producing strains from soil around the roots of the maple tree. isolated strains were identified using 16s rrna gene sequencing. after identifying of the bacteria (enterobacter hormaechei), endoglucanase enzyme gene was amplified using degenerate primers at first and then by specific primers with restriction enzymes sequences. dna fragment and plasmid vector were treated by specific restriction enzymes and then ligated to each other. then recombinant plasmid transferred to the e. coli bl-21 as expression host and kinetic properties of recombinant enzyme were evaluated. expression of the target protein was done by stimulating the lac operon by using 1 mm of iptg and the kinetic features of the recombinant enzyme such as vmax and km evaluated as 45 µmol/min and 1.4 mg/ml respectively. the optimum conditions for enzyme activity tend to be 37°c at a ph of 7.