کلون سازی کاسپاز9 در وکتور یوکاریوتی، بررسی بیان و سنجش عملکرد آن در سلول

مرگ سلولی برنامه ریزی شده فرایند مهمی است که طی تکامل بدون تغییر باقی مانده است. این فرایند در تنظیم شرایط فیزیولوژیکی و پاتوفیزیولوژیکی موثر است. آپوپتوز شناخته شده ترین نوع مرگ سلولی است که در بسیاری از تومورها مختل شده و سبب مقاومت به درمان می شود. کاسپاز9 یکی از پروتئین های کلیدی مسیر میتوکندریایی آپوپتوز است. فعال شدن کاسپاز9 منجر به فعال شدن کاسپاز های اجرایی مانند کاسپاز3/7 شده و با راه اندازی آبشار کاسپازی منجر به مرگ سلول می شود. در این مطالعه، ژن کاسپاز9 در وکتور یوکاریوتی pcdna3.1(+) کلون و عملکرد آن در سلول بررسی شد.مواد و روش ها: ژن کاسپاز9 طی pcr با پرایمر های اختصاصی تکثیر و پس از هضم دوگانه با آنزیم های kpni و bamhi به پلاسمید pcdna برش خورده الحاق شد. پلاسمید نوترکیب حاصل پس از تعیین توالی به رده سلولی sh-sy5y ترنسفکت و با داروی دوکسوروبیسین تیمار شد. عملکرد آن بر مرگ سلولی با روش رنگ آمیزی تریپان بلو و pi، و سنجش فعالیت کاسپاز3 بررسی و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد.یافته ها: کلونینگ ژن کاسپاز9 انجام و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد. افزایش بیان کاسپاز9 در سلول منجر به پردازش خود بخودی آن طی همودایمریزاسیون و در نتیجه القای مرگ سلولی شده و حساسیت سلول نسبت به دوکسوروبیسین را افزایش و زنده مانی سلولی را کاهش داد. ژن کاسپاز9 کلون شده در سلول فعالیت نشان داد و آپوپتوز را در حضور دوکسوروبیسین از طریق خود فعال سازی و متعاقبا تشدید فعال سازی کاسپاز3 افزایش داد.

cloning of caspase 9 in eukaryotic vector, investigation of its expression and functional assay in cell

programmed cell death is a vital cellular process that is highly conserved in evolution. apoptosis, as a common mode of programmed cell death, is disturbed in the most human malignancies and leads the resistance of cancers to current treatment strategies. caspase 9 is a key protein in mitochondrial apoptosis. activated caspase 9 leads to activation of caspase 3/7, initiating a caspase cascade and killing cell. in this study, caspase 9 gene was cloned into pcdna3.1(+) and its expression and function evaluated in cell.methods: pcr amplification of caspase 9 was performed by specific primers and ligated into pcdna3.1(+) after double-digestion with kpni and bamhi. after sequencing, pcdna/caspase 9 was transfected into sh-sy5y cells and treated with doxorubicin. caspase 9 function was determined by its effect on cell death level by trypan blue and pi staining, and caspase 3 activity, and its expression in cells measured by western blotting.finding: caspase 9 gene cloning was done and its expression in cell defined by western blot. overexpression of caspase 9 led to autoprocessing following homodimerization and induction of cell death and also increased cell sensitivity to doxorubicin treatment and declined cell viability. conclusion: the cloned caspase 9 was functional in cell and enhanced apoptosis in the treated cells by doxorubicin through self-activation and subsequently amplification of caspase 3 activation.