کلونینگ، بیان و تخلیص دیابادی anti-pdl-1 – anti- ctla-4 در میزبان e.coli با استفاده از تگ pelb

نقاط بازرسی ایمنی، مولکول هایی هستند که سیستم ایمنی را تنظیم می‌کنند. برخی از سلول های تومور می توانند لیگاندهای متصل شونده به این نقاط بازرسی ایمنی را برای فرار از پاسخ های ایمنی ضد توموری بیان کنند. برخی از عوامل، مانند آنتی بادی ها، می توانند این نقاط بازرسی را مهار کنند. هدف از این مطالعه بیان یک دیا‌بادی دو منظوره جدید در فضای پری پلاسمیک باکتری e. coli bl21(de3)  برای مهار همزمان‌ دو نقطه بازرسی ایمنی، پروتئین مرتبط با 4 (ctla 4) و لیگاند متصل شونده (pd l1)  است. دیا‌بادی دو منظوره بر اساس ژن نواحی متغیر آنتی‌بادی‌های anti pd-l1 و anti ctla 4 طراحی و جهت بیان درباکتری  e. coli bl21(de3) بهینه سازی و در پلاسمید بیانی pet21 کلون شد. پس از ترنسفرم کردن به داخل سویه بیانی e. coli bl21(de3) اثر شرایط بیانی مختلف کشت مورد بررسی قرار گرفت، بیانdia-21 با وزن مولکولی 55کیلو دالتون با الکتروفورز ژل sds-page و وسترن بلات تایید شد. بهترین شرایط برای بیان پری پلاسمیک به فرم محلول بیان با 0/5 میلی مولار iptg در دمای 23 درجه سانتی گراد محیط کشتlb  و زمان 18 ساعت به دست آمد. پروتئین بیان شده سپس با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز با بازده نهایی 0/4 میلی گرم در لیتر تخلیص و نهایت میل ترکیبی برهمکنش پروتئین خالص شده توسط  cell-elisa  بررسی شد. پروتئین دیا‌بادی نوترکیب در یک سیستم باکتریایی بیان و خالص‌سازی و برهم‌کنش پروتئین دیا‌بادی نوترکیب  باگیرنده سطح سلولی pdl-1 از طریق cell-elisa بررسی شد. 

cloning, expression of anti-pdl1/ anti-ctla-4 diabody using bacterial pelb leader sequence in e.coli bl21 strain

immune checkpoints are molecules that regulators  the immune system. however, some tumor cells can express the ligands of immune checkpoints to escape from antitumor immune responses. some agents, such as antibodies, can inhibit these checkpoints that prevent the immune system from targeting and killing cancer cells. the aim of this study was to express a novel bispecific diabody in periplasmic space of e.coli for simultaneous targeting of two immune checkpoints, cytotoxic t‑lymphocyte‑associated protein 4 (ctla‑4) and programmed death- ligand 1 (pd‑l1).the bispecific diabody was constructed based on the variable regions gene of anti pd-l1 and anti ctla‑4 antibodies. the optimum codon for expression in e. coli was chemically synthesized and subcloned in pet21 expression plasmid. after transformation, the effect of cultivation conditions on periplasmic expression of the protein in e. coli bl21(de3) was evaluated. then, the bispecific diabody was purified .expression of diabody with a molecular weight of 55 kda was verified by sodium dodecyl sulfate‑polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting analysis. the best condition for soluble periplasmic expression was obtained to be incubation with 0.5 mm isopropyl β‑d‑1‑thiogalactopyranoside at 23°c. the protein was successfully purified using affinity chromatography with a final yield of 0.4 mg/l. the affinity of the purified protein interaction were checked by elisa. recombinant diabody protein was cloned, expressed, and purified in a bacterial system and diabody interaction with pdl-1 receptor conformed by cell-elisa.