همسانه‌سازی، بیان و بررسی بیوانفورماتیکی ژن سرین پروتئاز aprx استخراج شده از باکتری bacillus licheniformis

هدف: پروتئازها از مهم ترین آنزیم های صنعتی محسوب می شوند. معمولاً برای تولید این آنزیم ها از باکتری های جنس باسیلوس استفاده می شود. هدف از این پژوهش همسانه سازی، تعیین توالی، بیان و بررسی بیوانفورماتیکی ژن سرین پروتئاز aprx استخراج شده از باکتری باسیلوس لیکنی فورمیس بود. مواد و روش ها: پس از استخراج dna باکتریایی، ژن سرین پروتئاز با نام aprx از باکتری bacillus licheniformis جداسازی و در ناقل ptg19-t  و سپس ناقل pet28a(+) همسانه سازی شد و ساختار مولکولی، ویژگی های بیوشیمیایی و فیلوژنتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت و ساختار سه بعدی آنزیم همسانه سازی شده پیش بینی شد. جهت القای بیان ژن نوترکیب سرین پروتئاز از القاگر iptg استفاده گردید و بیان پروتئین در غلظت های مختلف iptg، دماهای مختلف و زمان های گوناگون مورد بررسی قرار گفت. تایید بیان ژن aprx توسط آنالیز sds-page و دات بلاتینگ انجام شد. در ادامه نیز فعالیت آنزیم پروتئاز نوترکیب در دما و ph های گوناگون مورد سنجش قرار گفت.یافته ها: درستی همسانه سازی به وسیله توالی یابی تایید شد. بر اساس نتایج حاصل از بررسی های فیلوژنتیکی، توالی پروتئینی به دست آمده شباهت زیادی را با توالی های سایر باسیلوس ها نشان داد. پس از ارزیابی مدل ها مشخص گردید که مدل های ارائه شده توسط نرم افزارهای raptorx و i-tasser مدل های مطلوبی برای پیش بینی ساختار سه بعدی این پروتئاز هستند. تولید پروتئین نوترکیب با القاء iptg به میزبان حاوی پلاسمید pet28a-aprx با موفقیت انجام شد. بیشترین مقادیر بیان پروتئین نوترکیب در دمای 25 درجه و طی زمان 20 ساعت و با iptg 0.5 میلی مولار به‏دست آمد. هم چنین پروتئین نوترکیب تولیدشده در دمای 50 درجه سانتیگراد و ph:8 بیشترین فعالیت را نشان داد. نتیجه گیری: آنزیم کدشونده به وسیله این ژن در دسته آنزیم های پایدار قرار گرفته و به صورت محلول بیان خواهد شد. این مزایا موجب می شود که آنزیم مذکور به عنوان گزینه مناسب برای استفاده در صنعت در نظر گرفته شود.

isolation, molecular cloning, expression and bioinformatics evaluation of aprx serine protease gene extracted from bacillus licheniformis

introduction: proteases are the most important industrial enzymes. bacillus bacteria are commonly used to produce these enzymes. the aim of this study was cloning, sequencing, expression and bioinformatics study of aprx serine protease gene extracted from bacillus licheniformis.materials and methods: in this study, after extraction of bacterial dna, aprx serine protease genes was isolated from bacillus licheniformis and cloned into ptg19-t vector and then subcloned in pet28a vector. the molecular structure, its biochemical and phylogenetic properties were investigated and three-dimensional structure of the cloned enzyme was predicted. for the induction of gene expression and protein production of the recombinant serine protease iptg was used at different concentrations, different temperatures and different time periods. confirmation of aprx gene expression was performed by sds-page and dot blot analysis. then, the activity of recombinant protease enzyme was measured at different temperatures and phs.results: cloning was confirmed by sequencing. based on the results of phylogenetic studies, the obtained protein sequence showed a high similarity to the sequences of other bacillus species. after evaluating the drawn models, it was found that the models provided by raptrox and i-tasser software were desirable models for predicting the three dimentional structure of this protease. the recombinant protein production was successfully induced by iptg induction in the host containing the plasmid pet28a-aprx. the highest expression values were obtained at 25 ° c for 20 hours with 0/5 mm iptg. also, the recombinant protein produced showed the highest activity at 50 ° c and ph 8.conclusion: studies have shown that the enzyme encoded by this gene is inthe category of stable enzymes and will be expressed soluable in escherichia coli. these advantages make the enzyme is a suitabale candidate to be considered for use in industry.