جداسازی، خالص‌سازی و تعیین ویژگی‌های بیوشیمیایی آنزیم کاتکول 1و 2 دی اکسیژناز از فلور میکروبی خاک‌های آلوده نفتی

پژوهش حاضر با هدف خالص سازی و شناسایی بیوشیمیایی آنزیم تجزیه کننده فنول از باکتری های موجود در خاک های حاوی آلاینده های نفتی انجام پذیرفت. پروتئین کاتکول 1و 2 دی اکسیژناز از باکتریaneurinibacillus migulanus isolate znu05  استخراج و با استفاده از ستون کروماتوگرافی تبادل یونی  q-sepharoseتخلیص شد. فعالیت آنزیم در phهای مختلف بین 4 تا 9، محدوده دمایی20 تا 70 درجه سلسیوس، و در حضور نمک کلرید یون های فلزی مختلفی مانند 2+  ca، k+، mn2+،co2+ ،zn 2+،mg2+ ، cu2+، + na و حلال های گوناگون شامل اتانول، اتیل استات، پترولیوم اتر، استونیتریل، ان-آمیل الکل، ان-هگزان و تولوئن ارزیابی شد. همچنین فعالیت این آنزیم با استفاده از سوبستراهای گوناگون مانند فنول، کتکول، بنزوئیک اسید، پیروگالول و آلفا نفتول بررسی گردید. آنالیز پروتئین به روش sds-page بیانگر وجود تک باند پروتئینی با وزن مولکولی حدود 40 کیلودالتون بود. نتایج تعیین ویژگی آنزیم کتکول 1و2 دی اکسیژناز نشان داد که ph و دمای مطلوب به ترتیب 8.5 و 30 درجه سلسیوس بود. فعالیت کاتالیتیکی آنزیم در حضور یون های کلرید کبالت و روی (5 میلی مولار) و همچنین حلال آلی آمیل الکل، افزایش یافت، ولی دیگر یون های فلزی و حلال های آلی بکار رفته باعث کاهش و یا مهار فعالیت آنزیم شدند. از میان سوبستراهای مختلف بر روی فعالیت آنزیم، کتکول سوبسترای بسیار مطلوب تری برای آنزیم بود، به طوری کهvmax  و km آنزیم برای این سوبسترا به ترتیب 8.959 واحد بر میلی گرم و 4.992 میکرومول بر میلی لیتر می باشد.

isolating, purifying and determining of biochemical properties of catechol 1, 2 dioxygenase from microbial flora in petroleum-contaminated soils

the present study was accomplished to purify and biochemically characterize the phenol-degrading enzyme from the bacteria existed in petroleum-contaminated soils. the catechol 1, 2 dioxygenase was extracted from aneurinibacillus migulanus isolate znu05 and purified using q-sepharose ion exchange chromatography column. the enzyme activity was examined under different phs (ranged from 4 to 9), at different temperatures (ranged from 20 to 70˚c), in the presence of various metal ions chloride salts (ca2+, k+, mn2+, co2+, zn2+, mg2+, cu2+ and na+), and with various solvents (ethanol, ethyl acetate, petroleum ether, acetonitrile, n-amyl alcohol, n-hexane, and toluene). in addition, the enzyme activity was investigated using different substrates such as phenol, catechol, benzoic acid, pyrogallol and α-naphtol. sds-page analysis indicated that there was a single-band protein with a molecular weight of approximately 40 kda. the catechol 1, 2 dioxygenase had a maximum activity at temperature 30˚c at ph 8.5. moreover, the catalytic activity of the enzyme was increased in the presence of cobalt and zinc ions as well as organic solvent of amyl alcohol, while it was decreased or inhibited in the presence of the other metal ions and organic solvents used. among different substrates on enzyme activity, catechol was the most favorable for the enzyme, so that, the vmax and km were 8.959 u/mg and 4.992 µg/ml for the substrate, respectively.