تولید فاکتور 9 انعقادی انسانی هایپرگلیکوزیله در سلول‌های جنینی کلیه انسان (hek293) با رویکرد مهندسی گلیکوزیلاسیون

هایپرگلیکوزیلاسیون فرایندی است که در آن با استفاده از روشهای مهندسی ژنتیک و جهش زایی هدفمند یک جایگاه جدید n-گلیکوزیلاسیون (موتیف asn-xxx-ser/thr) به درون توالی اسیدآمینه ای پروتئین نوترکیب وارد می شود. در صورت اتصال گلیکن جدید به آسپاراژین موجود در این موتیف، هایپرگلیکوزیلاسیون رخ می دهد. این فرایند بویژه در صنعت تولید پروتئین های دارویی بسیار مورد توجه است. ویژگی های فارماکوکینتیکی داروهای نوترکیب، ممکن است تحت تاثیر گلیکن اضافه شده قرار گرفته و نیمه عمر آنها افزایش یابد. در این تحقیق، بر اساس مطالعات بیوانفورماتیکی، در دامنه گلای فاکتور 9 انسانی یک جایگاه جدید n-گلیکوزیلاسیون از طریق جهش زایی هدفمند مبتنی بر pcr و تبدیل کدون اسیدآمینه آرژینین شماره 37 به آسپاراژین ایجاد شد. توالی رمز کنندۀ فرم جهش یافته فاکتور 9  انسانی بطور موازی با توالی طبیعی (به عنوان کنترل)، در وکتور بیانی pcep4 مجهز به پروموتر ویروس سایتومگالو (cmv)، همسانه سازی شده و بیان آنها در سلول های hek293 مورد بررسی قرار گرفت. به منظور بررسی رخداد هایپرگلیکوزیلاسیون در نوع جهش یافته، از روش گرادیان sds-page دارای شیب غلظت آکریل آمید و به دنبال آن وسترن بلاتینگ استفاده شد که نشان دهنده سنگین تر بودن محصول جهش یافته نسبت به فرم طبیعی بود. همچنین پس از هضم با استفاده از آنزیم pngase هر دو محصول طبیعی و جهش یافته وزن مولکولی یکسانی کسب کردند. این نتایج نشان داد که افزایش وزن مولکولی پروتئین جهش یافته ناشی از اضافه شدن گلیکن جدید بوده و تایید کننده رخداد هایپرگلیکوزیلاسیون است. 

production of a novel hyper-glycosylated human coagulation factor ix in hek293 cells, using a glyco-engineering approach

hyper-glycosylation is an approach to introduce new n-glycosylation consensus sequence(s) (َasn-xxx-ser/thr three-peptide) into a protein primary amino acid sequences by site-directed mutagenesis which is followed by the attachment of a new glycan to the asn residue located within the three-peptide sequence. hyper-glycosylation has attracted lots of interest especially in the protein therapeutics industry. the attached glycan may improve the pharmacokinetic properties of the hyper-glycosylated priteins and increase their half-life in the bloodstream. in the current study, a new n-glycosylation site was introduced into n-terminal gla domain of hfix. arg37 position of mature hfix was targeted to be converted into asn residue by site-directed mutagenesis using overlap extension pcr. recombinant expression plasmids for native and mutant hfix were constructed. the expression of the recombinant wild-type and mutant hfix was analyzed in mammalian hek293 cells using gradient sds-page and western blotting analysis. the results indicated in higher molecular weight for r37n mutant in compared with the native protein. the glycan attachment to r37n mutant was further confirmed by pngase digestion and western blotting.