کلون‌کردن ژن survivin انسانی در وکتور پروکاریوتی pet-28a و ارزیابی بیان پروتئین در باکتری e.coli bl21(de3)

مهارکننده آپوپتوز (iap) یک خانواده از پروتئین ها هستند که با مهار فعالیت کاسپاز مرگ سلول را متوقف می کنند. survivin کوچکترین پروتئین شناخته شده از این خانواده است که در سلول های سرطانی مشاهده می شود اما در بافت های نرمال بجز بافت جنینی مشاهده نشده است. survivin ممکن است به عنوان یک مارکر جدید برای شناسایی و درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد. هدف از این پژوهش، کلونینگ ژن survivin در وکتور pet-28a  و بیان پروتئین در باکتری e.coli بود.ژن survivin با روش pcr و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و الگوی pcdna-survivin  تکثیر شد. محصول pcr و پلاسمید pet-28a با آنزیم های محدودگر  hindiii/nheiبرش داده و survivin درون وکتور برش خورده الحاق شد. سپس محصول الحاق شده به باکتری e.coli dh5a ترنسفورم و با استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین غربالگری شد. کلونی ها با روش pcr ارزیابی شده و پلاسمید کلونی مثبت با روش هضم دوگانه غربالگری شده، در نهایت یک کلونی مثبت با تعیین توالی تایید شد. پلاسمید نوترکیب با روش شیمیایی به باکتری بیانی e.coli (bl21)  ترنسفورم شد. بیان survivin  در شرایط مختلف انجام و سطح بیان با sds-page بررسی شد.  اندازه قطعه تکثیرشده توسط pcr با استفاده از ژل آگارز تایید شد. پلاسمید pet-28a برش خورده نیز فعالیت آنزیمی را تایید کرد. قطعه کلون شده پس از توالی یابی تشابه 100% با survivin انسانی داشت. افزودن iptg موجب بیان پروتئین survivin در تمام شرایط خصوصا در دمای 37 درجه سانتیگراد از زمان 2 ساعت پس از القا شد اما در تمام شرایط، عمده survivin بیان شده در باکتری به صورت تجمعی بود. 

cloning of human survivin in pet-28a and its protein expression study in e.coli bl21(de3)

aims the inhibitors of apoptosis proteins (iaps) are a family of proteins that block cell deaththrough caspase activity. survivin is the smallest iaps family member that overexpresses indifferent cancer types but not in normal tissue except embryonic tissue. survivin may be usedas a new marker to stratify cancer patients for more optimal treatment modalities. the aim ofthe current study was to investigate survivin dna cloning into pet-28a and its expression ine. coli.materials & methods the sequence of survivin gene was amplified by pcr using specificprimers and pcdna-survivin pattern. pcr product and pet-28a plasmid were digested byhindiii/nhei restriction enzymes and survivin was ligated into the digested vector. then,the ligation product was transformed into the e. coli dh5a competent cells and screened byantibiotic selection marker (kanamycin). positive colonies were selected by colony pcr andscreened by double digestion of isolated plasmid. one positive colony was sequenced andconfirmed. the recombinant plasmid was transformed into the expression strain of e. coli(bl21) by chemical method. the expression of survivin was induced in the different conditionsand expression levels investigated by sds-page.findings the size of pcr product in agarose gel showed the correctness of amplification. thedigested pet-28a plasmid also indicated the correctness of enzymatic reaction. the sequenceof the cloned fragment revealed a 100% similarity to the human survivin. in expressing, addingiptg increased the expression of survivin protein in all conditions, especially 37ᵒc from 2hafter induction. at all conditions, most of survivin accumulated in the bacteria as inclusion body.conclusion the wild type survivin gene was cloned into the pet-28a plasmid and theexpression of survivin into the expression strain of e. coli (bl21) was as in-soluble form mixedsoluble. the present study paves the way for producing this protein in e. coli.