بیان نوترکیب بخش c-ترمینال پروتئین rif1 و محلول سازی آن با سارکوزیل

ژنوم یوکاریوتی حاوی چندین محل شروع همانندسازی می باشد. بررسی ها نشان می دهد که روند و ترتیب فعال شدن این منشاها با نظم خاصی صورت می گیرد که این فرآیند منظم را اصطلاحاَ زمانبندی همانندسازی (replication timing) میگویند. مطالعات اخیر نشان می دهد که فاکتورهای زیادی در تنظیم زمانبندی فرآیند همانندسازی نقش دارند. یکی از مهمترین این فاکتورها پروتئین متصل شونده به rap1 (rif1)، می باشد که نقش اساسی را در تنظیم برنامه زمانبندی همانندسازی در مخمر و یوکاریوت های پیشرفته تر ایفا می کند. قسمت عمده ساختار این پروتئین به صورت نامنظم بوده و این ویژگی ها مانع از بیان rif1 به صورت پایدار شده و مطالعه بر روی آن را دشوار می کند.هدف از مطالعه کنونی بیان نوترکیب دمین cترمینال پروتئین rif1 موشی (murif1-ctd) به صورت محلول می باشد. بدین منظور ژن murif1-ctd از سازه یوکاریوتی حاوی ژن کامل rif1 به کمک pcr استخراج و در وکتور بیانی ppal7 که حاوی برچسب profinity exact بود، قرار گرفت. محلول سازی پروتئین با استفاده از دترجنت های مختلف و در مرحله بعد حذف دترجنت با استفاده از دیالیز صورت پذیرفت. به منظور اطمینان از اینکه پروتئین محلول شده دارای فعالیت است آنالیز برهمکنش پروتئین rif1 با ساختار g4 (که قبلا در رابطه با اتصال به rif1 معرفی شده بود) با روش ژل شیفت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی نشان داد که استفاده از دترجنت می تواند برای محلول سازی پروتئین rif1 بدون اثرگذاری بر مراحل خالص سازی آن مورد استفاده قرار گیرد. لیکن در مورد این پروتئین در صورت فقدان کامل دترجنت، این پروتئین به صورت محلول نخواهد بود.

Recombinant expression of C-terminal domain of Rif1 and its solubilization with sarkosyl

The eukaryotic genome contains several replication Origins. Studies showed that the phenomenon and order of the origin activation is in a a particular discipline, called the ldquo;Replication Timing . Recent studies show that many factors are involved in regulating the timing of the replication process. One of the most important factors amongst them is the Rap1 interacting Factor 1 (Rif1) protein, which plays a key role in regulating the replication schedule in yeast and more advanced eukaryotes. Structure of this protein is mostly irregular and these properties prevent Rif1 from being expressed in a stable manner and makes it difficult to study.The aim of the present study was to investigate the expression of recombinant Cterminal domain of mouseRif1(muRif1-CTD) protein in solution. For this purpose, the muRif1-CTD gene was extracted from eukaryotic constructs containing the complete Rif1 gene by PCR and was inserted into the pPAL7 expression vector comprising the Profinity eXact tag. Protein solubilization was carried out using different detergents and then detergent removal was performed by dialysis. In order to ensure that the soluble protein is active, the interaction analysis of the Rif1 protein with the G4 structures (previously reported to bind Rif1) was investigated using the gel shift assay. The results of this study showed the use of detergent for Rif1 solubilization without affecting its purification steps. But in the case of this protein, if the detergent is removed completely, it will not remain soluble.