کلون سازی و بیان دُمین خارج سلولی رسپتور 2 vegf انسانی در پیکیا پاستوریس و بررسی خواص اتصالی آن

آنژیوژنز غیرطبیعی با بیماری های مختلف نظیر سرطان و متاستاز آن، رتینوپاتی و آرتریت روماتوئید در ارتباط است. vegfa مهمترین واسطه ی آنژیوژنز در میان تمام فاکتورهای رشد است. فعالیت زیستی vegf توسط دو گیرنده تیروزین کینازی vegfr-1 و vegfr-2 سلول های اندوتلیال وساطت می شود. سیگنالینگ vegf از طریق vegfr-2 مسیر اصلی آنژیوژنز است که منجر به تحریک رشد سریع سلول های اندوتلیال به داخل تومور می شود. این رسپتور از یک بخش خارج سلولی، یک بخش سیتوپلاسمی و یک دُمین ترانس ممبران تشکیل شده است. بخش خارج سلولی متشکل از هفت دُمین شبه ایمونوگلوبولین (d1-d7) است که دُمین های اول تا سوم به عنوان جایگاه اتصال لیگاند عمل می کنند. در این مطالعه دُمین های خارج سلولی 3-1 گیرنده (kdr1-3) بصورت نوترکیب در pichia pastoris بیان شد. یک قطعه dna 975 نوکلوتیدی حاوی دُمین های 3-1 براساس توالی نوکلئوتیدی در genbank و توالی پروتئین در swiss-prot طراحی شد. وکتور بیانی ترشحی نوترکیب (ppink αhc/kdr1-3) ساخته شد و به روش الکتروپوریشن به داخل مخمر منتقل شد. سلول های نوترکیب با بیان بالا از طریق تکمیل اگزوتروفی آدنین شناسایی و کشت شدند. kdr1-3 تحت القا با متانول 1٪ بیان و با sds-page و تکنیک وسترن بلات تایید شد. پس از تخلیص با کروماتوگرافی تمایلی با رزین ni-nta، اتصال محصول بیان شده به hvegf165 با الایزای مستقیم و الایزای مبتنی بر گیرنده اثبات شد. نتایج نشان داد که دُمین خارج سلولی 3-1 گیرنده vegfr2 انسانی با ساختار پروتئین یوکاریوتی، که هیچ گزارشی در مورد آن وجود ندارد، با موفقیت بیان شد.

Cloning and Expression of Extracellular Domain of Human VEGF Receptor-2 in Pichia pastoris and Investigation of it's Binding Properties

Abnormal angiogenesis is associated with various diseases such as solid tumors and metastasis, retinopathies, and rheumatoid arthritis. VEGFA is the most important mediator of angiogenesis among all growth factors. The bioactivity of VEGF is mediated by two tyrosine kinase receptors VEGFR1 and VEGFR2 present on endothelial cells. VEGF signaling through VEGFR2 is the major angiogenic pathway that leads to stimulation of endothelial cell ingrowths into the tumor. It comprised of an extracellular portion, a cytoplasmic portion, and a short transmembrane domain. The extracellular portion consists of seven Iglike domains (D1 -D7), of which the 1st to 3rd domains function as ligandbinding sites. In the present work, a soluble recombinant extracellular domain 13 of VEGFR2 was expressed in Pichia pastoris to inhibit the VEGFinduced angiogenesis. The 975 bp DNA fragment containing extracellular domain 13 kdr, was designed according to the nucleotide sequence at GenBank and protein sequence at SwissProt. The recombinant secretory expression vector (pPink alpha;HC/KDR13) was constructed and transferred into yeast by electroporation. The high expression transformants were identified through complementation of adenine auxotrophy and cultured. KDR13 was expressed under the induction of %1 methanol and confirmed by using SDSPAGE and western blot techniques. After being purified by affinity chromatography using NiNTA resins, binding of expressed product to hVEGF165 was proved by two direct ELISA and ELISA receptor binding assays. The data showed that human VEGFR2 extracellular domain 13 with eukaryotic protein structure, that there is no reported paper about, was successfully expressed.