کلونینگ، بیان و تخلیص اندونوکلئاز cel i نوترکیب در رده سلولی hek293t

اندونوکلئاز cel i، آنزیمی از خانواده s1 اندونوکلئازها است. این آنزیم، با اختصاصیت بالا، توانایی شناسایی انواع جهش‌ها و جایگزینی بازها در مولکول dna را دارد که این امر اهمیت آن را در قالب محصولات تجاری به‌منظور مصارف تحقیقاتی و آزمایشگاه‌های بالینی دوچندان می‌کند. اگرچه این آنزیم در گیاه کرفس یافت می‌شود اما به‌دلیل زمان‌بربودن فرآیند استخراج و همچنین بازدهی کم محصول نهایی، استخراج آن مقرون‌به‌صرفه نیست. علاوه بر این، با توجه به لزوم اعمال تغییرات پس از ترجمه برای دست‌یابی به ساختار فعال نهایی، تاکنون گزارشی مبنی بر بیان فرم فعال این آنزیم در میزبان‌های باکتریایی مشاهده نشده است. بنابراین یکی از منابع تولید فرم فعال این آنزیم، کلون و بیان آن در میزبان‌های یوکاریوتی از جمله مخمر و رده‌های سلولی پستانداران است. در این مطالعه، توالی ژن به‌منظور بیان در میزبان یوکاریوتی hek293t بهینه‌ سازی و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزیم‌های kpni و xhoi در وکتور بیانی pbudce4.1 ساب‌کلون شد. سازه بیانی مورد نظر توسط لیپوفکتامین به رده سلولی hek293t ترانسفکت و بیان پروتئین نوترکیب از طریق روش‌های متعددی از جمله sdspage، الایزا، واکنش نسخه‌برداری معکوس و وسترن‌بلات تایید شد. آنالیز داده‌های sdspage و وسترن‌بلات وزن مولکولی در حدود 30کیلو دالتون را تایید کرد. تخلیص با ستون حاوی رزین ninta انجام و مقدار پروتئین در حدود 0/2میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تعیین غلظت شد. درنهایت فعالیت اندونوکلئازی آنزیم، روی dna هترودوپلکس حاصل از محصول pcr ژن جهش‌یافته و وحشی بررسی شد. نتایج نشان داد که بیان این پروتئین در میزبان hek293t فعالیت مناسبی دارد.

Cloning, Expression, and Purification of Recombinant CEL I Endonuclease in HEK293T Cell Line

CEL I endonuclease pertaining to the S1 endonuclease family. The enzyme, with its high specificity, has the ability to identify different types of mutations and base replacement in the DNA molecule, which makes it important in commercial products to use in research and clinical laboratories. Although the enzyme exists in the celery plant, the extraction of the enzyme is a timeconsuming process and not economical and the yield of the final product is low. In addition, due to its posttranslational modifications to achieve the final active structure, no report has published to indicate the expression of the active form of this enzyme in the bacterial hosts yet. Therefore, one of the production sources of the active form of this enzyme is its cloning and expression in eukaryotic hosts, including yeast and mammalian cell lines. In this study, in order to express CEL I endonuclease, its gene sequence was optimized and synthesized in host eukaryotic HEK293T. CEL I was subcloned by double digest with KpnI and XhoI enzymes in the pBudCE4.1expression vector. The expression construct was transfected into the HEK293T cell line by lipofectamine transfection. Expression of the recombinant protein after transfection into HEK293T cells was confirmed by multiple methods including polyacrylamide gel electrophoresis, ELISA, RTPCR, and western blot reaction. The analysis of SDSPAGE and western blot data confirmed the molecular weight of approximately 30kDa. Purification was carried out with the NiNTA column and the amount of purified protein was determined to be about 0.2mg/ml. Finally, the activity of endonuclease enzyme was investigated on both normal and mutated heteroduplex DNA amplified by PCR. The results showed that the expression of this protein in HEK293T host had shown sufficient activity.