کلون‌کردن dna و بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در باکتری اشریشیاکلی

اهداف: شناخت ساختار و عملکرد پروتئین آلفا سینوکلئین می‌تواند زمینه‌ساز توسعه روش‌های درمانی مناسب علیه بیماری پارکینسون باشد. هدف پژوهش حاضر، کلون‌کردن dna و بیان پروتئین آلفا سینوکلئین در باکتری اشریشیاکلی بود.مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، توالی کدکننده آلفا سینوکلئین موجود در پلازمید نوترکیب prk172، به کمک روش pcr و با استفاده از پرایمرهای مناسب تکثیر شد. dna سنتزشده توسط آنزیم‌های محدودگر sali وhindiii بریده و در حامل‌ pet28a کلون و پلازمید نوترکیب به روش کلسیم کلراید به سویه بیانی باکتری اشریشیاکلی (bl21) منتقل شد. بیان آلفاسینوکلئین توسط محلول iptg القا و بیان پروتئین نوترکیب با روش الکتروفورز sdspage ارزیابی شد. ردیف‌سازی توالی‌ها به کمک الگوریتم clustalw با برنامه bioedit 5.0.9 صورت پذیرفت.یافته‌ها: در محصولات واکنش‌های برش آنزیمی dna و پلازمید pet28a با آنزیم‌های محدودگر، اندازه قطعات، نشان‌دهنده صحت واکنش‌های آنزیمی بود. dna تکثیرشده و پلازمید pet28a مورد استفاده به‌ترتیب با طول‌های 407 و 5369 نوکلئوتید بودند. ترجمه حاصل از توالی قطعه کلون‌شده، تشابه 100% با پروتئین آلفا سینوکلئین انسانی را نشان داد. در بیان پروتئین نوترکیب در قیاس با نمونه‌های شاهد منفی، افزودن iptg موجب افزایش بیان پروتئین آلفا سینوکلئین در تمامی نمونه‌ها به‌ویژه 2 ساعت پس از القا شد. بیشتر آلفا سینوکلئین بیان‌شده از پلازمید pet28aalphasynuclein به‌صورت اجسام گنجانده در باکتری تجمع یافتند.نتیجه‌گیری: پروتئین آلفا سینوکلئین در پلازمید pet28a کلون و تشکیل اجسام گنجانده توسط آلفا سینوکلئین به‌هنگام بیان از سامانه pet28aalphasynuclein تایید می‌شود و راه را بر تولید این پروتئین در مقیاس بالا هموار می‌سازد.