تاثیر جهش در جایگاه 330 آنزیم لوسیفراز بر ساختار و عملکرد

لوسیفراز حشره شب تاب p. py یک آنزیم پراکسیزومی است که موجب تبدیل سوبسترای هتروسیکلیک لوسیفرین به یک حدواسط اکسی لوسیفرین در حضور mg+2 ndash;atp و اکسیژن مولکولی می شود. اکسی لوسیفرین برانگیخته با نشر نور مریی به حالت پایه می رسد. لومینسانس به دلایل متعددی از جمله سرعت سنجش، حساسیت بالا و آسان بودن روش کار، کاربرد وسیعی دارد. برخلاف کاربرد متعدد، لوسیفراز در برابر تغییرات فیزیکی و شیمیایی بسیار حساس است بنابراین حساسیت و دقت آن کاهش می یابد. لوسیفراز در برابر دماهای بالا و هضم پروتئولیتیکی بسیار ناپایدار است. براساس مطالعات قبلی، با پروتئولیز محدود این آنزیم توسط تریپسین، شش جایگاه برش در دو ناحیه سطحی پروتئین واقع در دمین انتهای n شناسایی شد 220206 (شامل k206، r213 و r218) و 341329 (شامل k329، r330 و r337). در این مطالعه، جهش زایی هدفدار در ناحیه r330 صورت گرفت که آرژنین با گلوتامین جایگزین شد و اثر آن بر ساختار و عملکرد لوسیفراز مورد بررسی قرار گرفت. براساس نتایج پروتئولیز محدود، این جهش تاثیر قابل توجهی نسبت به نمونه وحشی نداشت اما چندین تغییر مانند تغییر ph اپتیمم از 5/7 به 8 و افزایش غیرفعال شدن حرارتی در خصوصیات آنزیم ایجاد کرد. براساس نتایج، اگرچه آرژنین 330 یک رزیدوی حفاظت شده است ولی روی پایداری در برابر هضم پروتئولیتیکی تریپسین تاثیری نداشت.

Impact of Mutation at Position 330 of Luciferase on the Structure and Function

Luciferase from firefly Photinus pyralis (P .py) is a peroxisomal enzyme that converts a heterocyclic substrate luciferin to an excited state oxyluciferin in the presence of Mg+2ATP and O2. Excited oxyluciferin with the emission of visible light is changed to its ground state. The combination of rapidity, sensitivity, and convenience has led to the development of a broad range of luminescence applications. In spite of wide ranges applications, firefly luciferase is unstable against changes in chemical and physical conditions, thereby reduce its precision and sensitivity. The most undesirable instability of the luciferase is low thermostability and high susceptibility to proteolytic degradation. According to previous studies, limited proteolysis by trypsin of P .py luciferase indicated six cleavage sites on two accessible regions: 206220 (Including K206, R213, and R218) and 329341 (Including K329, R330, and R337) on Nterminal domain. In this study, we used sitedirected mutagenesis to introduce one point mutation on the 329341 accessible regions of P. py luciferase, in order to investigate the role of R330 on the enzyme structure and function which R330 changed to Q. Based on limited proteolysis data, R330Q mutant didn rsquo;t significantly change compared to wild type, but this mutation caused several alterations in enzymatic properties including shifting the pH optimum from 7.5 to 8 and increasing the thermal inactivation. Based on the results, it can be concluded that whilst Arg330 is a conserved residue but not effects on trypsinolysis stability.