مقایسه پایداری ترمودینامیک و بازتاخوردگی سینتیک آنزیم لوسیفراز گونه ایرانی و برخی جهش‌یافته‌های آن

اهداف: احتمال برقراری میان کنش های الکتروستاتیک به علت فراوانی رزیدوهای باردار آب دوست به ویژه آرژنین به عنوان مهم ترین فاکتور پایدارکننده دمایی آنزیم های گرمادوست مطرح شده است. هدف این مطالعه، مقایسه پایداری ترمودینامیک و بازتاخوردگی سینتیک آنزیم لوسیفراز گونه ایرانی و برخی جهش یافته های آن بود.مواد و روش ها: در مطالعه تجربی حاضر، پایداری گرمایی و نحوه بازتاخوردگی آنزیم لوسیفراز گونه ایرانی لامفیریس ترکستانیکوس و 3 جهش یافته err, err/i232r, err/q35r/i182r/i232r توسط تکنیک های مختلف اسپکتروسکوپی بررسی شد. به منظور بیان بالای پروتئین ها یک تک کلونی از هر یک از نمونه ها انتخاب و به 10میلی لیتر محیط کشت lb دارای کانامایسین با غلظت 50میکروگرم بر میلی گرم تلقیح و در دمای c deg; 37 و با هوادهی مطلوب به مدت 1512 ساعت انکوبه شد. به منظور تهیه محتوای سلولی از باکتری ها، محیط کشت القاشده به مدت 5 دقیقه در 5000گرم و دمای c deg; 4 سانتریفوژ شد. نتایج از طریق مطالعات با روش های طیف سنجی دورنگ نمایی دورانی در ناحیه دور، نزدیک و فلورسانس ذاتی، مطالعات کالریمتری روبشی تفاضلی (dsc) و آزمایش های سینتیکی با استفاده از تکنیک جریان متوقف مبتنی بر فلوئورسانس به دست آمد.یافته ها: همراه با افزایش تعداد رزیدوی آرژنین در سطح پروتئین، پایداری و فشردگی ساختاری آنزیم های جهش یافته در مقایسه با آنزیم وحشی افزایش یافته و ترموگرام های حاصل از مطالعات کالریمتری روبشی تفاضلی نیز بیانگر افزایش اندکی در tm و آنتالپی کالریمتری پروتئین های جهش یافته نسبت به پروتئین وحشی بودند.نتیجه گیری: ثابت سرعت بازتاخوردگی آنزیم های جهش یافته نسبت به نوع وحشی افزایش پیدا کرده است. بهبود پارامترهای ترمودینامیک و سینتیک ناشی از بهبود میان کنش های الکترواستاتیک است که منجر به درجه بالاتری از فشردگی و تراکم ساختاری می شود.

Comparison of Thermodynamic Stability and Kinetic Refolding of Lampyris turkestanicus and Some of Its Mutants

Aims: The probability of establishing electrostatic interactions due to the abundance of charged hydrophilic residues and especially arginine is considered the most important thermal stabilizing factor of thermophilic enzymes. The current study was conducted with the aim of comparing thermodynamic stability and kinetic refolding of Lampyris turkestanicus and some of its mutants.Materials and Methods: In the present experimental thermal stability and the way of refolding Lampyris turkestanicus and 3 mutations, including ERR, ERR/I232R, ERR/Q35R/I182R/I232R were investigated by various spectroscopic techniques. In order to high expression of proteins, a single clone of each sample was selected and inoculated into 10ml of LB culture medium, containing Kanamycin at a concentration of 50 mu;g/mg and incubated at 37 deg;C with an ideal aeration for 1215 hours. The culture medium was centrifuged for 5 minutes at 5000g at 4 deg;C to provide the cellular contents of the bacteria. The results were obtained through spectroscopic methods of remote and near circular dichroism, intrinsic fluorescence, differential scanning calorimetry, and kinetics experiments, using fluorescencestopped flow technique.Findings: Along with the increase in the number of arginine residues at the protein level, the stability and structural compression of the mutated enzymes in comparison with the wild enzyme were increased and the thermograms obtained from differential scanning calorimetry showed a slight increase in Tm and calorimetric enthalpy of mutated proteins in comparison with wild protein.Conclusion: The rate constant of refolding mutated enzymes has increased compared with the wild type. The improvement of thermodynamic and kinetic parameters results from the improvement of electrostatic interactions, which results in a higher degree of compression and structural density.