بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات دومین متصل‌شونده به Ip3 نوع 2 انسانی

اهداف: ip3 یک مولکول کلیدی تنظیم کننده در مسیر انتقال پیام است و با اتصال به گیرنده های درون سلولی ip3r روی سطح ذخایر کلسیم داخل سلولی باعث آزادسازی کلسیم به درون سیتوپلاسم می شود. هدف این پژوهش، بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات دومین متصل شونده به ip3 )ip3bd:1-604 aa( نوع 2 انسانی بود.مواد و روش ها: در پژوهش تجربی حاضر، پلاسمید pet28a حامل ژن ip3bd با روش شیمیایی به داخل باکتری های بیانی e.coli سویه bl21) de3( منتقل شد. برای بهینه سازی بیان در سیستم باکتریایی، بیان در شرایط مختلف مورد بررسی قرار گرفت و دماهای بیان مختلف از جمله 16، 18، 20 و c24 °، زمان های مختلف بعد از القا، نوع القاکننده و غلظت های مختلف آن بررسی شد. باکتری های القاشده براساس شوک حرارتی از طریق کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل سفارز تخلیص و میزان خلوص پروتئین از طریق sds-page بررسی شد. نشر فلورسانس دومین متصل شونده به ip3 در حضور و عدم حضور لیگاند ip3 در طول موج 295نانومتر اندازه گیری شد.یافته ها: پروتئین در محیط های lb و tb و 2xyt بیان قابل توجهی نداشت و در زمان های مختلف تغییری در آن مشاهده نشد. بیان پروتئین باکتری در دمای c20 ° براساس شوک حرارتی c42° نسبت به تمام حالات بیشتر بود. تخلیص باکتری های القاشده براساس شوک حرارتی به سختی تکرار می شد و نمونه های خالص شده نیز غلظت بالایی نداشتند. نشر فلورسانس پروتئین در حضور لیگاند ip3 کاهش یافت.نتیجه گیری: بیان باکتریایی دومین متصل شونده به ip3 از گیرنده نوع 2 گونه انسانی ضعیف است، ولی با القای شوک c42° بیان پروتئین تا حدود نسبتاً زیادی افزایش می یابد.

Expression, Purification, and Characterization of IP3-binding Domain from Human Type 2

Aims: IP3 is a key regulator molecule in the message transmission pathway, and releases calcium into the cytoplasm by binding intracellular IP3R receptors on the surface of the internal calcium stores. The aim of this study was expression, purification, and characterization of IP3binding domain from human type 2.Materials and Methods: In this experimental study, the pET28a plasmid of the carrier of the IP3BD gene was transferred to the E.coli expression strain BL21 (DE3) by chemical method. In order to optimize the expression in the bacterial system, the expression was studied in different conditions, and various temperatures such as 16, 18, 20, and 24 deg;C, the different times after incubation, type of inducer, and its different concentrations were investigated. The induced bacteria were purified on the basis of thermal shock through nickel column for chromatography and the purity of the protein was measured through SDSPAGE. The fluorescence emission of IP3binding domain was measured in the presence and absence of an IP3 ligand at wavelength of 295nm.Findings: Protein did not have a significant expression in LB, TB, and 2xYT environments, and no changes were observed at different times. Expression of bacterial protein at 20 deg;C based on thermal shock of 42 deg;C was higher than in all cases. The purification of the induced bacteria was difficultly repeated due to thermal shock, and the purified samples did not have high concentrations. The fluorescence emission of the protein decreased in the presence of the IP3 ligand.Conclusion: The bacterial expression of IP3binding domain from human type 2 is weak, but the expression of protein increases with the induction of shock of 42 deg;C.