بهینه‌سازی بیان، تخلیص و ارزیابی طیف ‌سنجی فلوئورسانس آنزیم کراتیناز در حضور نانوذرات طلا

اهداف: امروزه استفاده از روش‌های بر پایه واکنش‌های آنزیمی با هدف پایش سلامت افراد به خصوص در حوزه نیروهای نظامی و انتظامی رواج گسترده‌ای یافته است. یکی از روش‌های آنزیماتیک، استفاده از آنزیم کراتیناز برای سنجش کراتین و کراتینین در مایعات جهت بررسی سلامت کلیه‌ها، عضلات و غده تیروئید است. هدف این تحقیق بهینه‌سازی بیان آنزیم کراتیناز و بررسی اثر نانوذرات طلا بر پایداری آنزیم کراتیناز بود.مواد و روش‌ها: این پژوهش در بهار و تابستان سال 1400 در موسسه الکتروشیمی واقع در دانشگاه تهران انجام شد. در این مطالعه ابتدا باکتری e.coli bl21 حاوی وکتور تکثیری pet28a در محیط tb کشت شد، سپس در دماهای 18، 22، 28، 32 و 37 درجه القا گردید. در ادامه پس از سونیکاسیون، تخلیص آنزیم‌ها با کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. پس از تایید بیان با sds-page، غلظت آنزیم‌های بیان‌شده در دماهای القای متفاوت با روش برادفورد اندازه‌گیری و مقایسه شد. در ادامه فعالیت آنزیم‌ها با روش رنگ‌سنجی بررسی و مقایسه گردید. نهایتاً با روش طیف‌سنجی فلورسانس، اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتیناز مورد بررسی قرار گرفت.یافته‌ها: بررسی میزان بیان آنزیم کراتیناز در دماهای مختلف در محیط کشت tb نشان داد که در دمای 28 درجه، بیشترین مقدار آنزیم با بالاترین میزان فعالیت حاصل شد. از طرفی طیف‌سنجی فلورسانس آنزیم کراتیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا در طول موج تهییج 295 نانومتر، کاهش شدت فلورسانس در حضور نانوذرات طلا را نشان داد.نتیجه‌گیری: القای بیان در 28 درجه‌ سانتی‌گراد در محیط کشت tb، آنزیمی فعال‌تر و غلیظ‌تر ارائه می‌دهد. همچنین نانوذرات طلا باعث کاهش شدت فلورسانس آنزیم شد که می‌تواند نشانگر تغییر در ریزمحیط آمینواسید فلورسانت در ساختار آنزیم کراتیناز باشد.

expression optimization, purification, and fluorescence spectroscopic assessment of creatinase enzyme in the presence of gold nanoparticles

introduction... [1]. nowadays, the use of laboratory methods and kits based on enzymatic reactions to monitor the health of individuals, especially in the field of military forces, has become widespread. the use of the creatinase enzyme is one of the enzymatic methods for the clinical assay of creatine and creatinine in body fluids [2]. the use of recombinant proteins and enzymes in scientific research has increased. molecular cloning of dna is one way to produce recombinant proteins into bacterial chromosomal dna. today, this technology is used to produce recombinant proteins in clinical and industrial research [3]. ... [4]. one of these enzymes is creatinase (creatine aminohydrolase) [5]. due to the role of creatine in increasing the synthesis of adenosine triphosphate (atp) and its equilibrium reaction with creatinine, this enzyme is an important indicator for measuring the health of the kidneys as well as muscles. therefore, measuring the level of creatine and creatinine in blood serum and urine can indicate the function of the kidneys and muscles [6]. pseudomonas putida is one of the bacteria that produce this enzyme. genetic engineering is used for the mass production of this enzyme [7]. ... [8-12]. due to the instability of the enzyme produced, it is necessary to use a method to stabilize the enzyme. various methods are used to stabilize enzymes, including the addition of nanoparticles [13]. ... [14-16]. in 2012, yadav et al. investigated the effect of iron oxide and chitosan nanoparticles on keratinase stability [17]. also in 2017, afshari et al. examined the activity and expression of the keratinase enzyme in a liquid lb growth medium at different expression temperatures [18].aim (s)this study aimed to optimize the induction temperature for mass production of more active keratinase enzyme and also to investigate the effect of gold nanoparticle stability on the structure of keratinase enzyme for use in serum and urinary creatinine and creatinine kits for faster and more accurate diagnosis of kidney and muscle diseases.research society, place, and timethis research was conducted in the spring and summer of 2021 in the electrochemical institute at the university of tehran, iran.used devices & materialsthe materials used were growth medium (merck), iptg (fermentas), kanamycin (duchefa), sds-page (merk), bsa (merck), ni-nta sepharose (qiagen), and buffer (merck). to use the enzyme creatinase to measure creatine and creatinine in body fluids enzymatically, it is necessary to express the enzymes highly and purify them. for this purpose, e. coli strain bl21 (expression vector pet28a containing pseudomonas putida creatinase gene has been transformed) was first cultured in a liquid tb medium. after induction of the gene of the enzyme for its high expression (over expression), the bacterial cell wall was destroyed by a sonicator (20s sonike and 40s rest up to 15 pulses). to purify the enzyme, the affinity chromatography method (using a nickel-sepharz column) was used. the expressed recombinant enzymes have a histidine sequence (his6-tag) at the amine end (n-terminal). this histidine sequence has a strong affinity for nickel and interacts strongly with it. finally, to separate the proteins attached to the column,( elution buffer) containing 300 mm nacl, imidazole 250 mm, tris / hcl 50 mm with ph=8 was used.