فرابیان ژن شبه استریکتوسیدین سینتاز6- در گیاه arabidopsis thliana

استریکتوسیدین سینتاز یک آنزیم کلیدی مسییر بیوسنتز ایندول الکالوئیدهای مونوترپنی می‌باشد. آرابیدوپسیس قادر به تولید ترکیبات آلکالوئیدی نیست اما، ژن‌هایی مشابه استریکتوسیدین سینتاز در آن شناسایی شده است. ژن ssl6 از اعضاء خانواده ژنی شبه استریکتوسیدین سینتاز آرابیدوپسیس می‌باشد که در این تحقیق پاسخ ژن آن به تیمار شوری بصورت کمی بررسی و سپس در گیاه آرابیدوپسیس فرابیان شد. بمنظور تولید موتانت فرابیان ژن ssl6 rna کل استخراج و رشته اول cdna با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن ساخته شد. کلون سازی ابتدایی در ناقل pjet انجام و متعاقبا به سازه فرابیانی گیاهی (ppzpy:ssl6) منتقل شد. در ترانسفورماسیون آرابیدوپسیس از اگروباکتریوم نژاد gv3101(pmp90) و تکنیک غوطه‌وری گل‌آذین استفاده شد. آنالیز گیاهان تراریخت احتمالی در ابتدا با کشت بذرهای حاصل از گیاهان تلقیح شده بر روی محیط گزینشی حاوی آنتی بیوتیک جنتامایسین و گزینش گیاهچه‌های مقاوم انجام شد. در ادامه گیاهان تراریخت احتمالی در طی واکنش pcr با پرایمرهای اختصاصی ژن ssl6 با تولید الگوهای باندی متفاوت در الکتروفورز در مقایسه با گیاهان وحشی و همچنین پرایمرهای اختصاصی ژن مارکر جنتامایسین جداسازی شدند. میزان افزایش بیان ژن انتقال یافته نسبت به گیاه مادری با واکنش real-time pcr بر روی گیاهان نسل t2 انجام و نتایج نشان داد افزایش بیان ژن ssl6 در گیاهان تراریخته به طور قابل ملاحظه‌ای بالاتر از گیاه مادری بوده است. تعدادی لاین تراریخت حاوی یک نسخه تراژن از طریق تفرق صفت مقاومت به آنتی‌بیوتیک جنتامایسین در محیط کشت انتخابی در نسل t2 و t3 انتخاب شدند. بررسی کمی بیان ژن ssl6 در گیاهان وحشی col-0 نیز نشان داد که تنش شوری موجب افزایش معنی‌دار بیان ژن، شش ساعت پس از اعمال تیمار شد.

Overexpression of Strictosidine Synthase Like6 Gene in Arabidopsis thaliana

The monoterpenoids comprise a family of structurally and pharmaceutically diverse alkaloids. Strictosidine synthase is a key enzyme in monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis pathway. In spite of the apparent lack of complex alkaloids in Arabidopsis, a gene family called Strictosidine synthase like (SSL) has been found in the genome. SSL6, a member of SSL family, has been induced significantly by various stresses and signaling molecules. An overexpressed mutant is a powerful tool for functional characterization of an unknown gene. In view of that, SSL6 overexpressed mutant have been generated in order to study the possible role of the gene in Arabidopsis defense against biotic and abiotic stresses. The open reading frame from SSL6 was amplified and cloned into intermediate pJET vector before subcloning into pPZPY122 plant vector. Plant transformation was made by floral dip method using Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (PMP90). The putative transgenic plants were isolated on selective MS medium containing gentamycin. Transgene integration was further analyzed by PCR using SSL6 and gentamycin resistance gene specific primers. The transcription level of SSL6 in the T2 plants was measured using qPCR and indicated an overexpression in transgenic compared to wild type Col0 plants. Segregation ratio of plants in T2 and T3 generation on selection medium proved that some of the genotypes contain single TDNA insert. The SSL6 Expression level in response to salt stress was measured in Col0 and indicated an upregulation of the gene 3, 6 and 12 hrs after treatment.