طراحی و ساخت ناقل بیانی گیاهی واجد ژن نشانگر مقاومت به آنتی‌بیوتیک هیگرومایسین

ناقلین دوتایی مرسوم مبتنی بر pbi121 که هنوز به طور گسترده‌ای در انتقال ژن به گیاه به‏‌‏وسیله آگروباکتریوم استفاده می‌شوند،‌ به‌علت عدم کارآیی گزینش‌گر کانامایسین، در برخی از گیاهان تک‌لپه‌ای‌ قابل استفاده نیستند در حالی که مقاومت به هیگرومایسین یک نشانگر گزینشی پرکاربرد و مهم در تراریختی برخی گیاهان به‌ویژه تک‌لپه‌ای‌ها به شمار می‌رود. از این رو در مطالعه حاضر، بهبود ناقل‌ pbi121 برای تراریختی گیاهان تک‌لپه‌ای مورد نظر قرار گرفت. به این منظور، ژن مقاومت به هیگرومایسین به همراه خاتمه‌دهنده 35s از پلاسمید p6ubirnai به‏‌‏وسیله آنزیم‌های برشی smaі‌ و notі، جداسازی و در ناقل حدواسط pbluescript همسانه‌سازی شد. در ادامه، با استفاده از آنزیم‌های hindiii و smai، پیش‌بر camv 35s از بدنه حامل pbi121 جداسازی و در بالادست این ژن در ناقل pbluescript قرار داده شد. با استفاده از آنزیم‌های hindiii و eco53ki، کاست کامل ژن مقاومت به هیگرومایسین جایگزین کاست ژن مقاومت به کانامایسین (که با استفاده از آنزیم‌های hindiii و mssi حذف شده بود) در ناقل pbi121 شد. صحت ساخت ناقل جدید توسط روش pcr، بررسی الگوی هضم آنزیمی و توالی‌یابی تایید شد. با توجه به محبوبیت سری ناقلین مبتنی بر pbi121 نسبت به سایر ناقلین موجود و آشنایی محققین با نحوه دستورزی آنها، کارایی ناقل معرفی شده در این مطالعه می‌تواند در پژوهش‌های انتقال ژن به گیاهان تک‌لپه مورد بررسی قرار گیرد.

Designing and construction of a plant expression vector containing the hygromycin antibiotic resistance marker gene

Conventional pBI121based binary vectors are widely used in transformation of higher plants mediated by Agrobacterium but they are useless in transformation of some monocots because of inefficiency of kanamycin in selection, while, hygromycin resistance gene is an important selectable marker that usually used in transformation of several plants, especially monocots. The aim of this study was to improve the pBI121 vector for transformation of monocot plants. For this purpose, the hygromycin resistance gene with the 35S terminator were isolated from p6ubirnai plasmid and cloned into pBlueScript intermediate vector via SmaІ and NotI restriction enzyme digestion. The CaMV 35 promoter was isolated from pBI121 vector by using SmaI and HindIII enzymes and cloned upstream of the gene. By using HindIII and Eco53KI enzymes, the complete hygromycin resistance gene cassette was replaced the kanamycin resistance gene cassette (which digested by HindIII and MssI) of pBI121 vector. Construction of this vector was confirmed by PCR method, digestion pattern analysis, and sequencing. Due to the popularity of pBI121based vectors than other binary vectors and the researchers’ familiarity with their manipulation, the vector which is introduced in this study could be used in gene transfer studies of monocot plants.