کلونینگ، بیان و خالص سازی آنزیم لیپاز جهش‌ یافته Geobacillus thermocatenulatus در مخمر Pichia pastoris

لیپازها یکی از پرکاربردترین آنزیم‌ها در صنایع بیوتکنولوژی و شیمی آلی هستند به طوری که به عنوان سومین آنزیم صنعتی اهمیت فراوانی داشته و مطالعات بسیاری بر روی آنها در حال انجام می‌باشد. لیپازهای باکتریایی از خانواده β/α هیدرولازها بوده که تری‌گلیسریدها را در حدفاصل آب و چربی کاتالیز و هیدرولیز می‌کنند. اغلب لیپازهای گرمادوست پایداری بالایی در دماهای بالا و حلال‌های آلی نشان می‌دهند و به همین علت در بررسی‌های ساختاری و کاربرد‌های صنعتی در مرکز توجه قرارگرفته‌اند. مقایسه‌ ساختاری β/α هیدرولازها با لیپازهای باسیلوس نشان داده که دمین x3 طی تکامل وارد ساختار لیپازهای باسیلوس شده است. در این تحقیق دمین x3 از ساختار ژن لیپاز باکتری geobacillus thermocatenulatus به منظور بررسی اثر آن بر فعالیت آنزیم با روش soe-pcr حذف شد. ژن جهش‌یافته btl2 در وکتور کلونینگ pptzrt/57 و سپس وکتور بیانی ppiczαb کلون و پس از خطی شدن با روش الکتروپوریشن به مخمر pichia pastoris gs115 انتقال داده شد. مخمر نوترکیب pichia pastoris در محیط ypd کشت داده و با افزودن متانل به محیط کشت بیان لیپاز القا شد. بررسی محیط کشت با الکتروفورز sds-page و تست پارانیتروفنیل پالمیتات تولید و ترشح لیپاز به محیط کشت را تایید کرد. لیپاز ترشحی در محیط کشت توسط یک مرحله کروماتوگرافی تعویض یونی خالص شد و آنزیم با روش وسترن بلات تایید شد. بررسی‌ها نشان داد که آنزیم لیپاز جهش‌یافته btl2 به خوبی توسط مخمر pichia pastoris بیان و به خارج سلول ترشح می‌شود. نتایج نشان داد کهpichia pastoris احتمالا سیستمی مطلوب در بیان بسیاری از پروتئین‌های نوترکیب در صنعت است.