بررسی اثر ویرایش ژن mapkkkε سیب زمینی با استفاده از فناوری crispr در مواجهه با phytophthora infestans

کینازهای فعال شونده با میتوژن (mapks)، از آبشارهای پروتئینی مهم، در درون سلول‌های یوکاریوتی هستند که نقش کلیدی مهمی در مسیرهای سیگنالینگ ایمنی در جانوران عالی بازی می‌کنند. آبشارهای پروتئینی مسیر mapk، دارای ژن‌های متعددی هستند که در این میان، ژن‌های mapkkk در بالادست آبشار کینازی قرار دارند و از این‌رو در دریافت پیام از پروتئین‌های غشایی نقش اساسی را بازی می‌کنند. ژن mapkkkε، تنظیم کننده مثبت مرگ سلولی مرتبط با ایمنی در سلول‌های گیاهی می‌باشد. شبه قارچ infestans phytophthora یک اوومیست بیماری‌زای گیاهی است که باعث ایجاد بیماری سوختگی دیررس سیب‌زمینی می‌شود. این قارچ پروتئین‌های افکتور rxlr را جهت تعدیل سیگنال‌های ایمنی میزبان و بالا بردن شانس کلونیزاسیون خود به داخل سلول‌های گیاهی تزریق می‌نماید. افکتور pexrd2 از گروه rxlrها، با دومین کینازی پروتئین mapkkkε، تعامل دارد و بنابراین به‌نظر می‌رسدکه از آن به‌عنوان یک ژن حساسیت استفاده می­کند. به‌منظور ایجاد جهش در ژن mapkkkε، از یک سیستم crispr/cas9، با بیان هم زمان چهار rna راهنما (grna)، استفاده شد. تعداد 35 لاین تراریخت به کمک سیستم crispr/cas9، در جریان کشت بافت باززایی شدند که به‌ترتیب در سه و دو لاین حذف و اضافه شدگی قطعات به‌وسیله pcr و سپس توالی‌یابی تایید شد. لاین‌هایی با سه آلل جهش یافته‌ در ژن mapkkkε گیاه سیب‌زمینی تولید شدند. در این لاین‌های تراریخت، میزان بیان ژن mapkkkε حدود 70 درصد کاهش یافت که به دنبال این موضوع، حساسیت به infestans p. در گیاهان تراریخت افزایش پیدا کرد. نتایج این مطالعه نشان داد که ویرایش ژن mapkkkε به‌طوری که تعامل آن با افکتور pexrd2 مختل گردد، موجب افزایش حساسیت به infestans p. می‌شود. این یافته بر این موضوع دلالت دارد که mapkkkε نقش مهمی در مقاومت گیاه سیب‌زمینی به infestans p. دارد و لذا می‌توان از این ژن برای افزایش مقامت به بیماری بلایت سیب‌زمینی در برنامه‌های به‌نژادی استفاده نمود. 

investigating the effect of stmapkkkε gene editing using crispr technology against phytophthora infestans

mitogen activated protein kinase (mapk) cascades are key players in plant immune signalling pathways. map kinase singling consists of a number of associated proteins where mapkkks are located upstream of mapk cascade activating multiple mapks. mapkkkε, a positive regulator of cell death, is associated with plant immunity. phytophthora infestans is a pathogenic oomycete that inflicts potato late blight disease, delivering rxlr effector proteins to plant cells to modulate host immune signalling and colonization incident. the rxlr effector pexrd2 interacts with the kinase domain of mapkkkε. using a crispr/cas9 system, a construct was made to introduce four guide rnas (grnas) in potato cultivar, agria. thirty-five mutant lines were regenerated, in which three and two transgenic lines with deletions and insertions were analysed, respectively. a mutant line with a three-allelic knock down of mapkkkε was obtained, showing ~70% reduction in mapkkkε expression level resulting in enhanced susceptibility to p. infestans. the results of this study provide evidences that editing mapkkkε to modulate pexrd2 interaction, enhances susceptibility to p. infestans, suggesting that mapkkkε plays a key role in resistance to p. infestans in potato. therefore, it can be anticipated that mapkkkε gene can be used in future potato breeding programs to generate biotic stress resistance plants.