بیان و تخلیص آنزیم cas9 در باکتری e. coli

ویرایش ژنوم مبتنی بر فناوری crispr/cas9 (کریسپر) به عنوان ابزار قدرتمندی برای اصلاح گیاهان زراعی بسرعت در حال گسترش است. یکی از مزایای این فناوری امکان دستورزی ژن های هدف بدون درج dna خارجی در گیاه است. برای این منظور نیاز است که آنزیم cas9 و rna  راهنما بصورت کمپلکس پروتئین-rna (rnp) به سلول گیاهی منتقل شود. از اینرو تولید cas9 در آزمایشگاه مقدمه آزمایشات کریسپر مبتنی بر rnp است.هدف این پروژه بیان و تخلیص آنزیم cas9 در باکتری e. coli می باشد. در این پژوهش ژن cas9 در ناقل بیانی pbadm30 کلون و به باکتری  e. coliسویه ی codonplus منتقل شد. بیان cas9 با اعمال 2/0 درصد l-arabinose  القا شد و سپس از کل پروتئین محلول جداسازی شد. سپس آنزیم cas9 توسط با استفاده از ستون میل ترکیبی نیکل تخلیص شد. حضور cas9  در پروتئین کل و پروتئین تخلیص شده با استفاده از الکتروفورز sds-page تایید شد. نتایج حاصل از کلونی pcr و هضم دوگانه ی آنزیمی وجود ژن cas9 در ناقل pbadm30 را تایید نمود. نتایج  sds-page حضور پروتئین با وزن ملکولی حدود 180 kda را در پروتئین کل نشان داد. همچنین وجود یک تک باند با وزن ملکولی حدود 180 kda در دو فرگشن بافر شستشو ی حاصل ار رزین نیکل نشان داد که پروتئین هدف به درستی تخلیص شده است. آنزیم cas9 در باکتری  e.coli  با موفقیت بیان و تخلیص شد. با توجه به نتایج به دست آمده می توان  گفت که پس از سنجش فعالیت کاتالیکی آنزیم cas9 می توان از این آنزیم به همراه  rna راهنما و ساخت کمپلکس rnp و انتقال آن به گیاه با روش پروتوپلاست یا الکتروپوریشن در پژوهش های بعدی استفاده کرد

expression and purification of cas9 enzyme in e. coli

genome editing based on crispr/cas9 technology is rapidly expanding as a powerful tool for crop breeding. one of the advantages of this technology genome editing without introducing foreign dna into plant genome.to achieve this, cas9 and guide rna need  delivered  to plant cell in form of protein-rna complex (rnp). hence the production of cas9 enzyme in laboratory is the first step of crispr based on rnp method. here, we evaluated the expression and purification of recombinant cas9 protein in e. coli. in this study cas9 gene was cloned into pbadm30 vector and transferred to the e. coli  codonplus strain. the result of colony pcr and double digest confirmed the presence of cas9 gene into pbad vector. cas9 expression was induced by applying 0.2% l-arabinose and then isolated from the total soluble protein. cas9 protein was also purified from cell crude extract using nickel affinity chromatography. the purification was analyzed by sds-page and show the presence of a 180 kda band in the fraction collected during the elution step. the cas9 protein in e. coli was successfully expressed and purified. according to the obtained results, it can be said that after measuring the catalytic activity of cas9 enzyme, this enzyme can be used together with guide rna and fabrication of rnp complex and its transfer to the plant by protoplast or electroporation method in further research.