جداسازی و تعیین خصوصیات پروموتر ژن سینامات 4-هیدروکسیلازدر ریحان

اسانس ریحان (ocimum basilicum l.) سرشار از ترکیبات فنیل پروپانوئیدی مانند فنیل سینامات، متیل چاویکول، متیل اوژنول و اوژنول می باشد. در مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها ژن‌های کلیدی مهمی از جمله سینامات4 هیدروکسیلاز دخالت دارد. امروزه با توجه به اهمیت پروموتر در دستکاری‌های ژنتیکی، انتقال ژن و تولید متابولیت های ثانویه در گیاهان، آگاهی از توالی پروموتر و عناصر تشکیل‌دهنده‌ آن ضروری می باشد. بنابراین در این تحقیق با استفاده از روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز نامتقارن دمایی (thermal asymmetric interlaced pcr) توالی ناحیه بالادست ژن سینامات4 هیدروکسیلاز در گیاه ریحان شناسایی شد. در این تحقیق از دو نوع آغازگر که از نظر طول و دمای اتصال باهم متفاوت‌ هستند استفاده شد تا توالی هدف تکثیر گردد. آغازگرهای نوع اول اختصاصی با دمای اتصال بالا و دارای سه توالی متفاوت بود. آغازگرهای نوع دوم اختیاری (شش عدد) با طول کوتاه و دمای اتصال پایین بود. واکنش های tail pcr در سه مرحله صورت گرفت که در مرحله دوم و سوم به ترتیب از فرآورده‌های رقیق‌ شده مراحل اول و دوم به‌عنوان dna الگواستفاده گردید. بعد از الکتروفورز محصولات pcr و شناسایی باند مورد نظر، قطعه مورد نظر از ژل آگارز استخراج و تلخیص گردید و توالی یابی آن در دو جهت انجام گرفت. آنالیزهای بیوانفورماتیکی توالی با استفاده از برنامه‌های softberry, plant care, place وneural network promoter prediction انجام گرفت و مشخص شد پروموتر مورد نظر 794 جفت باز طول دارد. ناحیه tata box این پروموتر در اطراف نوکلئوتید 35 و ناحیه شروع رونویسی 170 نوکلئوتید بالا دست کدون آغاز ترجمه قرار دارد. چندین ناحیه تنظیمی عملکردی نظیر caat box ،w box، g box و i box نیز در توالی پروموتر شناسایی شد. بنابراین پروموتر شناسایی شده (بعد از ارزیابی و تایید نهایی) می تواند در برنامه های انتقال ژن و دستکاری های ژنتیکی در گیاه ریحان جهت افزایش برخی متابولیت های با ارزش استفاده شود.

Isolation and characterization of cinnamate- 4-hydroxylase gene promoter in Ocimum basilicum L.

Basil (occimum basilicum L.) essential oil is a rich source of phenylpropaniod compounds such as phenyl cinnamate, methyl chavicol, methyl eugenol and eugenol. Cinnamate4hydroxylase (C4H) is one of the important key genes involved in phenylpropanoid biosynthesis. Nowadays considering the importance of the promoter in genetic manipulation, gene transfer and the production of secondary metabolites in plants, identification of the promoter sequence and its constituent elements is necessary. Hence, in the current investigation, thermal asymmetric interlaced PCR (TAILPCR) was used to identify the upstream sequences of the C4H gene in O. basilicum L. In this method two series of primers differing in length and annealing temperature were applied to amplify the target sequence: three specific primers with high annealing temperature and different sequences and six random primers with a short length and low annealing temperature. TAILPCR was performed in three stages which in the second and third stages, diluted PCR product of the first and second stages were used respectively as the template. After electrophoresis of the PCR products and identification of the interested band, the fragments were extracted and purified from the agarose gel, and sequenced in both directions. Subsequent bioinformatic analysis of the sequenced fragment using PLACE, PLANT CARE, Softberry and Neural Network Promoter Prediction softwares revealed a sequence with a length of 794 bp. The TATA Box of the promoter was recognized around nucleotide 35 and the transcription initiation site was 170 nucleotides upstream of the initiation codon. A group of various putative functional regulatory elements such as CAAT box, W box, Gbox and I box were also identified in the promoter. Therefore, the promoter detected (after validation), may be used in the gene transfer and manipulation programs in basil for enhancement of the valuable metabolites.