بهینه سازی بیان آنزیم سلوبیوهیدرولاز cel6b در باکتری e. coli bl21(de3)

مصرف انرژی و تاثیر آن بر محیط‌زیست یکی از بزرگترین چالش‌های بشر است و تولید اتانول زیستی یا سایر مواد شیمیایی به وسیله هیدرولیز آنزیمی سلولز می‌تواند تاثیر مهمی در جایگزینی سوختهای فسیلی و کاهش تولید co2 در اتمسفر داشته باشد. آنزیم cel6b از باکتری گرمادوست thermobifidia fusca، یک cbhii متعلق به خانواده بی سلولازهاست که تا c ° 55 مقاوم به حرارت است. به علت میزان پایین تولید این آنزیم در میزبان اولیه جهت مصارف صنعتی، ابتدا باید تولید آن در سیستم‌هایی نظیر باکتری، بهینه‌سازی شود. در این پژوهش، از آغازگرهای اختصاصی جهت تایید وجود ژن cel6b در وکتور psz143 استفاده شد سپس وکتور psz143 حاوی ژن cel6b با روش شوک حرارتی به سلول‌های مستعد e. coli bl21(de3) منتقل شد. پس از استخراج پروتئین، بیان یک پروتئین با وزن مولکولی 59.6 kda با استفاده از ژل الکتروفورز sdspage تایید شد. نتایج بهینه‌سازی تولید پروتئین نشان داد که بهترین زمان و بهترین غلظت iptg برای القا و بیان پروتئین در باکتری به ترتیب 6 ساعت بعد از القا و 0.8 میلی‌مولار است. فعالیت آنزیم سلوبیوهیدرولاز با استفاده از سوبسترای پنبه پیش‌تیمار شده با اسید فسفریک در باکتری لیزشده با روش dns مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت آنزیمی cel6b در هیدرولیز سلولز، در لیزات باکتری و محیط‌کشت آن پس از 6 ساعت القا با 0.8 میلی‌مولار از iptg ، به ترتیب 1.21 و u(mmol/min) / ml 0.07 به دست آمد و در نهایت نشان داده شد که میزان بیان پروتئین cel6b به علت پایین بودن شاخص cai (انطباق کدونی) و تفاوت کدون‌های مورد ترجیح e. coli، پایین است. همچنین با بررسی توالی سیگنال بومی این ژن در سرویس‌دهنده signal p4.1 عدم قابلیت ترشح این پروتئین در e. coli اثبات شد.

Optimization of cel6B enzyme expression in E. coli BL21(DE3)

Energy consumption and its impact on the environment is one of the greatest human challenges and the production of bioethanol or other chemicals by cellulose enzyme hydrolysis can have an important effect in replacing fossil fuels and reducing of CO2 production in the atmosphere. The Cel6B enzyme from Thermobifidia fusca, a thermal actinomist, a CBHII, belongs to the family of cellulases B, which is highly resistant to heat. Due to the low level of production of this enzyme in the primary host for industrial use, it must be optimized in systems such as bacteria. In this research, specific primers were used to confirm the presence of Cel6B gene in PSZ143 vector. Then, the PSZ143 vector containing the Cel6B gene was transferred by heat shock to E. coli BL21 (DE3) competent cells. After protein extraction, expression of a protein with a molecular weight of 59.6 KDa was confirmed using SDSPAGE. Optimization results of protein production showed that the best time and best concentration of IPTG for induction and expression of the protein in E. coli was obtained 6 hours after induction and 0.6 mM, respectively. Also, cellobiohydrolase (CBH) activity on Phosphoric acid pretreated cotton (PC) substrate in lysed bacteria, was investigated by DNS method. The enzyme activity of cel6B in cellulose hydrolysis, in bacterial lysis and its culture media was obtained after IPTG induction of 0.8 mM, 1.21 and 0.07 U(mmol/min)/ml, respectively. Finally It has been shown that the expression of the cel6B protein is low due to the low CAI (Codon Adaptation Index) and the difference in codons preferred by E. coli. Also, by checking the native signal sequence of the cel6B gene in the Signal P4.1 server, the inability to secrete this protein in E. coli was proven.