مهندسی فیتاز اشرشیا کلی به منظور پایدارسازی حرارتی

فیتازها آنزیم‌هایی هستند که اسید فیتیک دانه‌های گیاهی را هیدرولیز و فسفات را برای حیوانات قابل دسترس می‌کنند‌. این امر باعث می‌شود تا فیتاز به‌عنوان افزودنی جیره غذایی دام، طیور و ماهیان کاربری فراوانی داشته باشد. افزودن فیتاز به جیره غذایی باعث حفاظت محیط زیست و ممانعت از اثرات زیان بار افزودن فسفر معدنی و پدیده eutrophication می‌شود. کاربری وسیع فیتاز در علوم کشاورزی، دامداری و داروسازی نشان از اهمیت تولید طبیعی و نوترکیب فیتاز است. از آنجائی‌که افزودنی جیره غذایی تحت دمای 70 تا 80 درجه سانتی‌گراد مرحلهfood pelleting قرار می‌گیرد، لذا دستیابی به فیتاز پایدار در برابر حرارت هدف ایده‌ال است که با استفاده از روش‌های مهندسی پروتئین می‌توان به این هدف دست یافت. در این تحقیق پس از بررسی‌های بیوانفورماتیکی، ژن فیتاز سنتتیکbac phy-wild مطابق ترجیح کدونی میزبان طراحی و درون باکتری میزبان escherichia coli-dh5 alpha; کلون سازی شد. جهش‌زایی هدفمند با هدف افزایش پیوند‌های هیدروفوبی در جایگاه (s392w) انجام شد. ژن طبیعی و جهش‌یافته bac phymut به ناقل بیانی pet26b(+) انتقال‌یافته و سازه حاصل به درون escherichia coli-bl21 منتقل شد. نتایج الکتروفروز عمودی حضور خارج سلولی فیتاز با وزن مولکولی 42 کیلو دالتون را نشان داد. هم‌چنین بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی فیتاز‌های نوترکیب نشان داد که دمای بهینه 55 درجه سانتی‌گراد و ph بهینه 5 می‌باشد. مقایسه پایداری دمایی نمونه جهش‌یافته نسبت به نمونه طبیعی در دماهای40، 50، 60، 70 و 80 درجه سانتی‌گراد به‌ترتیب 18 ،24، 19، 9 و 6 درصد بهبود را نشان داد. نتایج مطالعه نشان داد که با استفاده از روش جهش‌زایی هدفمند می‌توان از فیتاز جهش‌یافته پایدار در برابر حرارت با کاربری در صنایع کشاورزی، دامپروری و محیط زیست به‌عنوان افزودنی جیره غذایی دام، طیور و ماهیان و هم‌چنین مصارف دارویی بهره برد.

Engineering of Escherichia coli phytase enzyme thermostability

Phytases are enzymes that hydrolysis phytic acid and makes mineral phosphorus available to animals. Natural and recombinant production of this enzyme is one of the important issues in protein engineering field. In this study, the synthetic Phytase gene Bac phywild was cloned into PUC57 vector and transformed to susceptible Escherichia coliDH5 alpha;. In order to replace the polar amino acid with nonpolar amino acid within the target mutagenic protein; we used a primer designed to tryptophan (S392W) for targeted mutagenicity in the amino acid serine 392 position. After confirming the mutation at the target site, the mutated gene was registered at the NCBI gene bank. To investigate the expression and temperature stability of the mutant enzyme and compare it to WT phytase, the WT and mutated Bac PhyMut genes were transferred to pET26b (+) expression vector. Recombinant vector construct was transferred to a to Escherichia coliBL21. After screening of recombinant clones, SDSPAGE analysis and protein concentration were used to evaluate the expression of recombinant protein. The results showed the presence of protein with a molecular weight of 42 kDa. Also the study of physicochemical properties of WT and mutated phytase showed that the optimum temperature was unchanged at 55 ° C and the pH was optimized to be 5. Comparison of thermal stability of the mutated phytase in compare with WT at 40, 50, 60, 70 and 80 ° C was improved by 18, 24, 19, 9 and 6%, respectively. Hence, the results of the current research showed that by using targeted mutagenesis method we succeed to improve the mutated phytase with higher thermal stability which could be obtained and mutant phytase could be used in the agricultural and environmental industries as food and feed additive of livestock, poultry and Fish as well as in medical application.