optimizing lipofectamine ltx complex and g-418 concentration for improvement of transfection efficiency in human mesenchymal stem cells

Conventional cancer therapies, including surgery, radiotherapy, and chemotherapy, are not tumor site-specific and have cytotoxic and harmful side effects for normal cells. mesenchymal stem cells (mscs), due to their tumor-tropism migration property, are a promising alternative to deliver and produce antitumor agents. however, mscs are difficult-to-transfect cells, and introducing the exogenous therapeutic gene into mscs is challenging yet needs improvement. transfection using chemical reagents, including lipofectamine, is more convenient and less cytotoxic compared with different methods of introducing exogenous dna into mscs. nonetheless, the major limitation of lipofectamine is low transfection efficiency in mscs. therefore, the purpose of this study was to evaluate and suggest the optimum quantities of lipoplex components to enhance the transfection efficiency of human adipose tissue-derived mscs (hascs). finding the best transgene expression time point and the optimum concentration of g-418 for antibiotic-based selection was another goal of this study. hascs were transfected in a series of experiments with altering the quantities of lipofectamine ltx® (lip- ltx), the related “plus” reagent, and a plasmid dna (pdna) expressing the enhanced green fluorescent protein (egfp). after transfection, the percentage of egfp-expressing cells was evaluated using fluorescence microscopy and imagej software in 12-hour intervals for 48 hours. also, the viability of hascs exposed to different concentrations of g-418 was measured using an mtt assay. the results demonstrated that a combination of 2 μl lip-ltx, 0.75 μl of its “plus” reagent, and 0.75 g pdna (6484 bp) improve the transfection efficiency of hascs (23.75%), and the best period for evaluation of fluorescence for these cells is 12 to 24h post-transfection. also, the optimum concentration of g-418 for antibiotic-based selection of hascs was 0.25mg/ml. in conclusion, this study indicates that the setting up of optimized quantities of lipoplex components and the golden time of evaluation for transgene expression could increase the possibility of transgene expression in hascs before beginning research and clinical application. also, the definition of optimal dose of selection antibiotic for purification of transfected hascs seems to be necessary for maximum transgene expression effects in the cell population.

بهینه سازی کمپلکس لیپوفکتامین LTX و غلظت G-418 به منظور بهبود کارایی انتقال ژن به سلول های بنیادی مزانشیمی انسان

روش های متداول برای درمان سرطان، از جمله جراحی ، پرتودرمانی و شیمی درمانی، به صورت اختصاصی بر سلول های توموری اثر نمی‌گذارند و برای سلول های طبیعی بدن عوارض جانبی مهلکی دارند. سلول های بنیادی مزانشیمی (MSCs) به دلیل گرایش ذاتی در مهاجرت به سمت بافت تومور، گزینه ای امیدوارکننده برای تحویل عوامل ضد توموری و یا تولید آن ها در موضع اختصاصی تومور هستند. با این حال، انتقال ژن های خارجی به داخل سلول های بنیادی مزانشیمی امری چالش برانگیز است، چرا که سلول هایی سرسخت در پذیرش ژن خارجی هستند. بنابراین ورود ژن به داخل این سلول ها نیاز به بهینه سازی دارد. انتقال ژن با استفاده از مواد شیمیایی از جمله لیپوفکتامین، در مقایسه با سایر روش‌ها راحت تر انجام می شود و سمیت سلولی کمتری دارد. با این حال، محدودیت اصلی در استفاده از لیپوفکتامین، پایین بودن کارایی انتقال ژن است. هدف این مطالعه ارزیابی و پیشنهاد مقادیر مطلوب اجزای لیپوپلکس (مجموعه لیپوفکتامین، بافر و DNA) برای افزایش کارایی انتقال ژن به سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی انسان (hASCs) بود. یافتن زمان بیان مطلوب ژن خارجی و غلظت مطلوب آنتی بیوتیک G418 نیز از اهداف دیگر این مطالعه بود. پس از انتقال ژن، درصد سلول‌های بیان کننده eGFP با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس و نرم افزار ImageJ در فواصل 12 ساعته به مدت 48 ساعت ارزیابی شد. همچنین میزان زنده‌مانی hASCs در مواجهه با غلظت‌های مختلف آنتی بیوتیک G418 با استفاده از روش MTT اندازه گیری شد. نتایج نشان داد که ترکیبی از 2 میکرولیتر لیپوفکتامین LTX به همراه 0.75 میکرولیتر بافر آن (&PLUS&) و 0.75 میکروگرم از DNA پلاسمیدی باعث بهبود کارایی انتقال ژن به hASCs به میزان 23.75٪ می‌شود. بهترین بازه زمانی برای ارزیابی بیان پروتئین فلئورسنت در این سلول ها، بین 12 تا 24 ساعت پس از انتقال ژن بود. همچنین، غلظت مطلوب آنتی‌بیوتیک G418 معادل 0.25 میلی گرم در میلی لیتر بود. در مجموع، نتایج این مطالعه نشان داد که احتمال بیان ژن خارجی با هدف درمانی در hASCs به مقدار بهینه شده اجزای لیپوپلکس و بازه زمانی طلایی برای ارزیابی وضعیت بیان آن ژن بستگی دارد.