development and evaluation of an indirect capripoxvirus elisa based on truncated p32 protein expressed in e. coli

As notifiable diseases, lumpy skin disease (lsd), sheep pox (spp), and goat pox (gtp) are associated with a profound effect on cattle, sheep, and goat farming industries. development of the elisa method could effectively facilitate serodiagnosis of the infected animals. this study aimed to develop an elisa system based on the recombinant full-length and truncated p32 protein (tr.p32) of goat pox virus. the p32 protein was expressed in rosetta strain of e. coli using pet24a+ vector and evaluated by sds-page and western blotting. then, tr.p32 was purified by ni-nta affinity chromatography under denaturing conditions and used to develop a capripoxvirus-specific elisa. checkerboard titration and receiver-operating characteristic (roc) analysis were used to optimize the elisa system and determine diagnostic specificity and sensitivity, respectively. the diagnostic potential of the developed elisa was evaluated using positive and negative control sera collected from goat, sheep, and cattle. results showed that the expression level of full-length p32 recombinant protein was negligible, while tr.p32, a ~ 31 kda recombinant protein, was expressed up to 0.270- 0.300 mg/200 ml of culture media. the results of checkerboard titration revealed that 675 ng/well of tr.p32 antigen and 1:10 dilution of control sera (anti gtpv his and healthy goat sera) caused maximum difference in absorbance between positive and negative goat sera. the recombinant tr.p32 showed good reactions with antibodies against gtp virus (gtpv), spp virus (sppv), and lsd virus (lsdv), whereas no cross- reactions with anti-orf virus antibodies were detected. by comparing with the neutralization index (ni), cut off, diagnostic sensitivity and specificity of the developed indirect-elisa were estimated, 0.397, 94% and 96.6%, respectively. these findings indicate that the elisa system based on tr.p32 protein could potentially be used in sero-surveillance of all capripoxviruses; however, further investigations are required.

راه اندازی و ارزیابی الایزای غیرمستقیم ویروس های کاپری پاکس با استفاده از بیان پروتئین P32 کوتاه شده در Ecoli

بیماری لامپی‌اسکین (LSD)، آبله‌ی گوسفندی (SPP) و آبله بزی (GTP)، به‌عنوان بیماری‌های اخطارکردنی، آثار شگرفی بر صنعت پرورش گاو، گوسفند و بز دارد. ایجاد و راه‌اندازی روش الایزا می‌تواند به‌طور موثری به تشخیص سرمی حیوانات آلوده کمک نماید. این پژوهش با هدف راه‌اندازی یک سیستم الایزا بر اساس پروتئین‌های نوترکیب P32 کامل و کوتاه شده (Tr.P32) ویروس آبله‌ی بزی انجام شد. پروتئین P32 با استفاده از وکتور pET24a+ در سویه Rostta باکتری Ecoli بیان شد و با استفاده از روش‌های SDSPAGE و وسترن‌بلاتینگ ارزیابی شد. سپس Tr.P32 در شرایط واسرشته‌سازی با استفاده از روش NiNTA کروماتوگرافی افینیتی خالص‌سازی، و برای راه‌اندازی الایزای اختصاصی ویروس‌های کاپری‌پاکس استفاده شد. سپس با روش تیتراسیون چکربورد و آنالیز ROC به ترتیب برای بهینه‌سازی سیستم الایزا و تعیین اختصاصیت و حساسیت آن استفاده شد. پتانسیل تشخیصی سیستم الایزای طراحی‌شده با استفاده از سرم‌های کنترل مثبت و منفیِ جمع‌آوری شده از بز، گوسفند و گاو ارزیابی شد. نتایج نشان داد که بیان پروتئین کامل P32 ناچیز بود در حالی‌که Tr.P32، به عنوان یک پروتئین نوترکیب 31 کیلو دالتونی، تا سطح 300/0270/0 میلی‌گرم به ازای هر 200 میلی‌لیتر محیط کشت بیان شد. نتایج بهینه‌سازی با روش چکربورد نشان داد که 675 نانوگرم Tr.P32 به ازای هر چاهک و رقت 1:10 از سرم‌های کنترلی (سرم‌های هایپرایمیون ضد ویروس آبله‌ی بزی و سرم‌های غیر ایمن) بیشترین اختلاف در جذب نوری بین نمونه‌های سرمی مثبت و منفی بزی را در پی داشت. پروتئین نوترکیب Tr.P32 واکنش خوبی با آنتی‌بادی علیه ویروس‌های آبله‌ی بزی (GTPV)، آبله‌ی گوسفندی (SPPV) و ویروس عامل LSD (LSDV) داشت، در حالی‌که هیچ‌گونه واکنش متقاطعی با ویروس Orf نشان نداد. با مقایسه نتایج شاخص خنثی‌سازی (NI)، cut off، و حساسیت و اختصاصیت تشخیصی سیستم الایزای غیرمستقیم طراحی شده به ترتییب 397/0، 94% و 6/96 درصد اندازه‌گیری شد. این یافته‌ها نشان داد که سیستم الایزای طراحی‌شده بر اساس پروتئین Tr.P32 می‌تواند برای استفاده در تشخیص سرمی همه‌ی ویروس‌های کاپریپاکس استفاده شود؛ با این حال، لازم است مطالعات بیشتری در این زمینه انجام شود.