evaluation and comparison of clostridium epsilon-alpha fusion gene expression using different commercial expression vector

Clostridium perfringens and clostridium septicum are gram-positive, anaerobic, spore-forming rods and pathogens for humans and livestock, which are widespread in nature as well as human and animal digestive systems. c. perfringens produces numerous different exoproteins, which are various systems of action. the major c. perfringens toxins include alpha, beta, epsilon, and iota. c. perfringens are classified into five groups (a-e) on the basis of the production of these lethal toxins. furthermore, toxins secreted from c. septicum include alpha, beta, delta, and gamma. epsilon and alpha toxins of c. perfringens and c. septicum are the major causes of enterotoxemia and braxy in sheep and goats, respectively. the production of recombinant immunogenic proteins of these bacteria using suitable expression vectors and expression prokaryotic hosts can be a convenient method for the reduction of the costs and production time of clostridial anaerobic vaccines. in the present study, recombinant escherichia coli strain top10 containing pjetεα was used for the evaluation of c. perfringens type d and c. septicum epsilon-alpha fusion protein using different commercial vectors. after the extraction of pjetεα from the recombinant cell, it was digested by ndei and xhoi restriction enzymes and subcloned into pet22b (+), pet26b (+), and pgem-b1 expression vectors in e. coli/rosetta and e. coli/bl21 (de3). the expression of recombinant fusion toxin was evaluated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting in three different temperatures, various isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (iptg) gradients, and different times using pgemεα, pet22εα, and pet26εα vectors in e. coli/rosetta and e. coli/bl21 (de3). according to the obtained results, recombinant e. coli/rosetta/pet22εα showed better expression at a temperature of 37°c after 6 h of induction by iptg.

ارزیابی و مقایسه بیان فیوژن ژن اپسیلون آلفای کلستریدیومی با استفاده از وکتورهای بیانی تجاری

کلستریدیوم پرفرینجنز و کلستریدیوم سپتیکوم باکتری های میله ای شکل گرم مثبت، بی هوازی و تولید کننده هاگ و برای انسان و دام بیماری زا بوده و به طور وسیعی در طبیعت و دستگاه گوارشی انسان و حیوان پراکنده اند. کلستریدیوم پرفرینجنز اگزوپروتئین های متعدد مختلفی تولید می کند که دارای سیستم های عملکردی مختلفی هستند. توکسین های اصلی کلستریدیوم پرفرینجنز شامل آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا است که بر اساس تولید این توکسین های کشنده به پنج گروه AE تقسیم می شوند. همچنین توکسین های ترشح شده از کلستریدیوم سپتیکوم شامل توکسین های آلفا، بتا، دلتا و گاما هستند. توکسین اپسیلون کلستریدیوم پرفرینجنز و توکسین آلفای کلستریدیوم سپتیکوم به ترتیب عامل اصلی بیماری انتروتوکسمی و براکسی در گوسفند و بز محسوب می شوند. تولید پروتئین های ایمونوژنیک نوترکیب این باکتری ها با استفاده از وکتورهای بیانی و میزبان های پروکاریوتیک بیانی می تواند روشی مناسب برای کاهش هزینه ها و زمان تولید واکسن های کلستریدیایی بی هوازی باشد. در این مطالعه از باکتری نوترکیب E. coli سویه TOP10 حامل پلاسمید نوترکیب pJETεα برای ارزیابی بیان فیوژن پروتئین اپسیلونآلفای کلستریدیوم پرفرینجنز تیپ D و کلستریدیوم سپتیکوم در وکتورهای تجاری استفاده شد. وکتورpJETεα ازسلول های نوترکیب استخراج و توسط آنزیم های محدودالاثر NdeI و XhoI برش داده شد و در وکتورهای بیانی pET22b(+)،pET26b(+) و pGEMB1 درE. Coli/Rosetta و E. Coli/BL21(DE3) ساب کلون گردید. بیان فیوژن توکسین نوترکیب در سه دمای مختلف، غلظت های مختلف IPTG و زمان های مختلف با استفاده از وکتور های نوترکیب pET22εα، pET26εα و pGEMεα در E. coli/Rosetta و E. coli/BL21(DE3) به روش SDSpage و western blotting ارزیابی گردید. بر اساس نتایج بدست آمده باکتری نوترکیب E. coli/Rosetta/pET22εα در37 درجه سانتیگراد و شش ساعت بعد از القا توسط IPTG بیشترین میزان بیان را نشان داد.