detection of leishmania infantum infection in reservoir dogs using a multiepitope recombinant protein (pq10)

Mediterranean visceral leishmaniasis is a zoonotic disease caused by leishmania infantum and transmitted by the bites of infected female sand flies. iran is one of the endemic areas of this disease. dogs and canines are the major reservoir hosts of leishmania infantum in the new and old world, including iran. if visceral leishmaniasis is left untreated, it may result in a 90% mortality rate. the identification and elimination of infected dogs are efficient ways to control this disease. the diagnostic methods used to identify these animals cannot yield 100% detection. therefore, in the present study, we used a multiepitope recombinant protein (pq10) to distinguish between symptomatic and asymptomatic infections caused by leishmania infantum in animal reservoirs (dogs). the coding sequence of pq10 recombinant protein was sub-cloned in pet28 expression vector and was commercially synthesized by generay biotechnology, china. in the following process, sequencing was performed with plasmid-specific primers and followed by the expression, optimization of expression. the purified recombinant protein was confirmed using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (sds-page) and western blot. the efficacy of recombinant pq10 protein was evaluated by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (elisa) test using 150 dog sera (25 symptomatic positive sera, 25 asymptomatic positive sera, 80 negative sera, and 20 sera of dogs with other infectious diseases). direct agglutination test (dat) as the standard method was used to compare and determine specificity and sensitivity. the results indicated that the sensitivity and specificity of elisa using infected dog sera were 94% and 86%, respectively. positive and negative predictive values for dog sera were reported as 87.03% and 93.47%, respectively. this protein was able to identify 92% of asymptomatic dogs with visceral leishmaniasis. the results showed that the recombinant protein pq10 is able to identify positive cases of canine visceral leishmaniasis, especially asymptomatic cases

شناسایی عفونت لیشمانیا اینفانتوم در مخازن سگی با استفاده از یک پروتئین مولتی اپی توپ نوترکیب (PQ10)

لیشمانیوز احشایی مدیترانه­ای بیماری زئونوزی است که توسط لیشمانیا اینفانتوم ایجاد و با گزش پشه خاکی ماده آلوده انتقال می­یابد. ایران یکی از مناطق اندمیک این بیماری می­باشد. سگ و سگ سانان میزبانان مخزن اصلی لیشمانیا اینفانتوم در دنیای جدید و قدیم شامل ایران هستند. در صورتی که بیمار مبتلا به لیشمانیوز احشایی درمان نشود، در 90% موارد منجر به مرگ می­شود. از راه­های کنترل موثر این بیماری، شناسایی و حذف سگ­های آلوده است. روش­های تشخیصی که برای شناسایی این حیوانات استفاده می­شوند نمی­توانند 100% آنها را تشخیص دهند. به همین دلیل ما در این تحقیق جهت تشخیص عفونت­های علامت­دار و بدون علامت ناشی از لیشمانیا اینفانتوم در مخازن حیوانی (سگ) از پروتئین نوترکیب مولتی اپی توپ PQ10 استفاده نمودیم. توالی کد کننده پروتئین نوترکیب PQ10 در وکتور بیانی pET28 ساب کلون شد  و توسط شرکت GENERAY  (چین) سنتز گردید. در مرحله بعد، توالی با پرایمرهای اختصاصی پلاسمید تعیین گردید و در نهایت مراحل بیان و بهینه سازی بیان صورت گرفت. پروتئین نوترکیب خالص با استفاده از SDSPAGE و وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت. ارزیابی کارآیی پروتئین نوترکیب PQ10 توسط آزمایش الایزای غیرمستقیم و با به کارگیری سرم 150 سگ (25 سرم مثبت از سگ علامت دار، 25 سرم مثبت از سگ بدون علامت، 80 سرم منفی و 20 سرم سگ­های مبتلا به سایر بیماری­های عفونی) انجام شد. جهت مقایسه و تعیین اختصاصیت و حساسیت از آزمایش آگلوتیناسیون مستقیم (DAT) به عنوان روش استاندارد استفاده گردید. نتایج نشان داد که حساسیت و اختصاصیت الایزا با استفاده از سرم سگ­های آلوده به ترتیب 94% و 86% است. ارزش اخباری مثبت و منفی در مورد سرم سگی به ترتیب 03/87% و 47/93% محاسبه گردید. این پروتئین قادر به شناسایی 92% از سگ­های بدون علامت مبتلا به لیشمانیوز احشایی بود. نتایج نشان می­دهد که پروتئین نوترکیب PQ10 قادر به شناسایی موارد مثبت لیشمانیوز احشایی سگی بالاخص موارد بدون علامت می­باشد.