بررسی ساختار جایگاه تراژن Cry1ab در برنج تراریخته طارم مولایی

میزان بیان تراژن و پایداری آن تحت تاثیر عواملی مثل ساختار کاست بیانی، الگوی تلفیق و ساختار جایگاه تراژن قرار می گیرد. ساختار جایگاه تراژن در سازوکارهای بیان آن اهمیت دارد. در این بررسی سعی شده است با جداسازی ردیف مجاور محل تلفیق تراژن cry1ab در برنج تراریخته طارم مولایی، ساختار جایگاه آن مشخص شود. برنج تراریخته طارم مولایی که از تراریزش همزمان دو پلاسمید pcib4421 و pchitihygii تولید شده دارای الگوی تلفیق ساده با بیان پایدار طی چندین نسل است. جهت بررسی ساختار جایگاه تراژن، ابتدا با استفاده از آغازگرهای طراحی شده از انتهای acute;3 و acute;5 ژن مقاومت به امپی سیلین، انتهای acute;3 ژن cry1ab و انتهای acute;5 پیشبر pepc بر روی پلاسمید pcib4421 و انجام پی.سی.آر، حدود محل شکست پلاسمید تعیین شد. سپس با توجه به محل احتمالی شکست برای جداسازی نواحی مجاور آن از دو راهبرد پی.سی.آر یکطرفه شامل tailpcr و splinkerette pcr استفاده شد. ردیف یابی قطعات تکثیر شده و بررسی های بیوانفورماتیک نشان داد که محل شکست در نسخه ی کامل 148 نوکلئوتید بعد از انتهای acute;3 ژن مقاومت به امپی سیلین است و 1496 نوکلئوتید از نواحی پایین دست محل شکست و 311 نوکلئوتید از نواحی بالا دست جداسازی شد. نتایج همردیف سازی این توالی ها با توالی پلاسمیدهای pcib4421 و pchitihygii و ژنوم برنج در پایگاه ncbi نشان داد که توالی پایین دست مخلوطی از قطعات پلاسمید و ژنوم برنج و توالی بالا دست نیز قطعات ناپیوسته ای از توالی پلاسمیدهای منتقل شده است

Study of cry1Ab transgene locus structure in a transgenic rice (Oryza sativa L., cultivar Tarom Molaii)

the level and stability of transgene expression can be influenced by factors such as structure of expression cassette, integration pattern and locus structure. The structure of transgene locus is important in its expression mechanisms. The aim of this experiment was to characterize the cry1Ab transgene locus structure in a transgenic rice (Oryza sativa, cultivar Tarom Molaii). This transgenic rice, cotransformed with two different plasmids (pCIB4421 and pChitIHygII), had a simple integration pattern and stable expression over several generations. In order to characterize the cry1Ab transgene locus stracture, the exact insertion site was identified using specific primers corresponding to 3 acute; and 5 acute; ends of ampR gene, 3 acute; end of cry1Ab gene and 5 acute; end of PEPC promoter on pCIB4421 plasmid. Then, DNA sequences of the flanking insertion sites were amplified using two methods of oneside PCR including TAILPCR and Splinkerette PCR. Sequencing of the PCR products and bioinformatics analysis revealed that pCIB4421 plasmid break for insertion was 148 bp after 3 acute; end of ampR gene. A fragment corresponding to 1499bp downstream sequences and 311 bp upstream of insertion site were isolated. BLAST search was performed against the pCIB4421, the pChitIHygII and Oryza sativa genome. Downstream sequences of the insertion site was scrambled fragments of delivered DNA and rice genome, however the upstream of the insertion site was noncontinuous fragments of the delivered DNA.