بهینه‌سازی بیان، خالص‌سازی و بررسی فعالیت آنزیم نوترکیب tth dna polymerase در e.coli bl21

کشف dna پلی‌مرازهای مقاوم به حرارت از میکروارگانیسم‌های گرمادوست جهش بزرگی در مهندسی ژنتیک ایجاد کرد. آنزیم tth dna polymerase (tth pol) از باکتری thermus thermophiles جزو آنزیم‌های پرکاربرد در مهندسی ژنتیک است. خاصیت دوگانه پلیمرازی و رونوشت برداری معکوس، مقاومت به بازدارنده‌های pcr موجود در نمونه‌های زیستی، تکثیر سریع‌تر dna در مقایسه با taq dna polymerase توجه محققان را به خود جلب کرده است. در این پژوهش، ژن کدکننده آنزیم tth pol از باکتری t.thermophilus جدا شد، و با وکتور ptz57r/t به باکتری e.coli dh5α منتقل شد. نتایج توالی‌یابی پلاسمیدهای نوترکیب صحت جداسازی ژن tth pol را تایید نمود. این ژن به وکتور بیانی pet28a الحاق شده و به میزبان بیانی e.coli bl21 منتقل شد. القای بیان با iptg در غلظت‌های 8/0 و 1 میلی‌مولار، در دو محیط کشت حداقل تغییریافته و lb، و دمای 25 و 30 درجه سانتی‌گراد انجام شد. نمونه‌برداری تا 10 ساعت پس از القا و در فواصل زمانی 2 ساعته ادامه یافت. الکترفورز نمونه‌های پروتئینی بیشینه بیان را در دمای 30 درجه، غلظت 1 میلی‌مولار iptg، محیط کشت حداقل تغییریافته و 10 ساعت پس از القا نشان داد. به دلیل وجود دنباله هیستیدینی در tth pol نوترکیب از رزین نیکل برای خالص‌سازی استفاده شد. پس از خالص‌سازی فعالیت پلیمرازی tth pol در pcr و فعالیت رونوشت برداری معکوس آن در سنتز cdna بررسی شد. نتایج نشان داد این آنزیم دارای هر دو ویژگی می‌باشد. با توجه به نتایج، بهینه‌سازی شرایط کشت در مقیاس وسیع‌تر مانند فرمانتور به منظور بیان بیشتر tth pol پیشنهاد می‌شود.

expression optimization, purification and activity of recombinant tth dna polymerase in e. coli bl21

the discovery of thermostable dna polymerase from thermophilic microorganisms has been a significant advancement genetic engineering. tth dna polymerase (tth pol) from the thermophilic bacterium thermus thermophilus is extensively used in genetic engineering. tth pol possesses reverse transcriptase and polymerase activity, tolerance to pcr inhibitors and a higher extension rate compared to taq dna polymerase, making it an attractive enzyme for researchers to use. in this study, the gene sequence of tth pol was isolated and transformed into e.coli dh5α after ligation to ptz57r/t. the recombinant plasmid sequencing confirmed the correct insertion. tth pol was then amplified with specific primers and ligated to pet28a. the recombinant plasmid was transformed into e.coli bl21. expression induction was performed with 0.8 and 1 mm iptg in lb and modified minimal medium at 25 °c and 30 °c. samples were taken at 2-hour intervals for up to 10 hours after induction. sds page of the samples revealed that the optimum condition for tth pol expression was 30 °c, with 1 mm iptg in modified minimal medium and 10 hours after induction. due to the presence of a histidine tag in the recombinant tth pol enzyme, nickel resin was used for purification. the purified tth pol activity was assessed in pcr, and its reverse transcription activity was evaluated in cdna synthesis. the results revealed that this enzyme has both activities. the findings from this study recommend optimizing cultivation conditions on a large scale, such as in a fermentor, to achieve higher expression of tth pol.