شناسایی یکی از موتیف‌های موثر در پایداری پروتئین atg8b در جایگاه lds در گیاه marchantia polymorpha

اتوفاژی یکی از پاسخ‌های دفاعی در موجودات مختلف در شرایط تنش و غیرتنش است. در اتوفاژی، ترکیبات و اندامک‌های آسیب‌دیده درون وزیکول دو غشایی به نام اتوفاگوزوم قرار می‌گیرند و به سمت واکوئل هدایت می‌شوند تا توسط آنزیم‌های هیدرولیتیکی واکوئل تخریب و به مواد اولیه تجزیه شوند. پروتئین atg8 مشخصه مسیر اتوفاژی است که در شکل‌گیری اتوفاگوزوم و قرارگیری محموله‌های هدف برای تخریب شدن درون اتوفاگوزوم نقش دارد. در مسیر اتوفاژی انتخابی، حضور پذیرنده محموله برای قرارگیری محموله درون اتوفاگوزوم نقش مهمی ایفا می‌کند. پذیرنده‌ها دارای موتیف اتصال به atg8 به نام aim‌ یا lir هستند که می‌توانند با دمین lds که جایگاه اتصال aim/lir‌ درatg8 است، میانکنش دهند. هرگونه تغییر در جایگاه lds و یا موتیف aim، سبب برهم خوردن میانکنش atg8‌ و پذیرنده می‌شود. در تحقیق حاضر، گیاه marchantia polymorpha با atg8b‌ جهش‌یافته در جایگاه lds از طریق جهش هدفمند در محل، ایجاد شدند تا برای مطالعات آتی برای شناسایی پذیرنده‌های احتمالی مورد استفاده قرار گیرند. بدین منظور از طریق بلاست پروتئینی، توالی پروتئین atg8b در گیاه مارکانتیا در پایگاه اطلاعاتی marchantia.info شناسایی شد. از طریق هم‌ردیفی پروتئین‌های atg8a از گیاه آرابیدوپسیس با atg8b‌ گیاه مارکانتیا، اسیدآمینه هایی که در تاخوردگی atg8 و شکل‌گیری جایگاه lds‌ نقش دارند، شناسایی شدند. دو آمینواسید لیزین 51 و آرژنین 70، جداگانه با روش جهش هدفمند در محل با آمینواسید آلانین جایگزین شدند. سپس پروتئین فلورسنت gfp‌ با کمک فناوری گرین‌گیت به پروتئین جهش‌یافته atg8b اتصال یافت. به منظور حفظ شرایط یکسان با گیاهان حاوی ژن atg8b‌ وحشی موجود در آزمایشگاه، با طراحی آغازگرهای سازگار با گیت‌وی، پروتئین‌های جهش یافته درون سازه بیانی pmpgwb303 وارد و پس از انتقال به اگروباکتری سویه‌ gwb303+psoup به گیاه انتقال داده شد. بررسی گیاهان تراریخته در آزمایشات وسترن بلات نشان داد که تنها فرم تغییر یافته لیزین به آدنین قابلیت بیان شدن و تشکیل پروتئین پایدار را دارد، در حالیکه با تغییر آرژنین به آلانین، پروتئین پایداری خود را از دست داده و قابلیت بیان ندارد.

Identification of one of the efficient motifs on the stability of ATG8B protein in LDS in Marchantia polymorpha

Autophagy is one of the defensive response pathways under stress and nonstress conditions in different organisms. In autophagy, damaged compounds and organelles are sealed into doublemembrane vesicles as an autophagosome. Autophagosome has been directed to the vacuole to be degraded by hydrolytic enzymes into initial substances. ATG8 proteins are the hallmark of this pathway. These proteins are involved in autophagosome formation and target cargo location inside the autophagosome. In selective autophagy, cargo receptors play an important role in trapping the cargo inside the autophagosome. There is the ATG8 binding motif called AIM or LIR in Cargo receptors. This motif makes able the cargo receptors interact with LDS, LIR docking site in ATG8. Any modification in the AIM motif or LDS could abolish the interaction between ATG8 and cargo receptors. In this study, ATG8B mutant in LDS has been generated in Marchantia polymorpha for future studies to identify the possible cargo receptors. In this order, the protein sequence of ATG8B has been identified in the marchntia.info database. Aligning ATG8A from Arabidopsis with ATG8B from Marchantia leads to identifying the residues involving in ATG8B folding and LDS formation. Two residues, Lysin 51 and Arginine 70, have been replaced with Alanine residue by sitedirected mutagenesis. The GreenGate has been used for fusing the GFP to ATG8B mutant fragments. To consider the same condition with wildtype ATG8B lines presented in the lab, by using the Gateway adapted primers, ATG8BLDS mutant has been cloned in the expression vector, pMpGWB303. After transforming to Agrobacterium GWB303+pSOUP strain, it has been transformed to the plants. Analyzing the transformed plants in western blot experiments has shown that the only form of modification that can express and fold as a stable protein is Lysine to Alanine modification, however, in the proteins with the mutation of Arginine to Alanine, protein is not stable, and it cannot be expressed.