پارامترهای فیزیکی و بیولوژیکی موثر در ایجاد گیاهان ترانسپلاستوم توتون به روش بمباران ذره‌ای توسط pds-1000/he

بهینه‌سازی پارامترهای موثر در روش بمباران ذره‌ای برای انتقال dna به کلروپلاست با کارایی بالا و بدون آسیب به بافت یک نیاز ضروری در ایجاد گیاهان ترانسپلاستوم می‌باشد. با توجه به تشابه نسبی موانع فیزیکی بر سر راه ورود ریزذرات به هسته و کلروپلاست معمولاً از ژن گزارشگر هسته‌ای gus استفاده می‌شود، ولی پارامترهای فیزیکی و بیولوژیکی درگیر در تراریختی پلاست‌ها بطور مستقیم گزارش نشده‌اند. در این تحقیق برای بهینه‌سازی انتقال ژن به کلروپلاست توتون پارامترهای نوع ریزذرات، غلظت dna، فشار هلیوم شتاب‌دهنده، آرایش برگ، فاصله شلیک و مدت زمان پیش‌تیمار ریزنمونه‌ها قبل از بمباران بررسی شد. پس از انتقال ناقل کلروپلاستی به ریزنمونه‌های‌ برگی، باززایی گیاهان ترانسپلاستوم در محیط گزینش حاوی mg/l 500 اسپکتینومایسین انجام شد. بیشترین تعداد ترانسپلاستوم (2.5 گیاه به ازای هر بمباران) از واحد آزمایشی شلیک شده با ریزذرات تنگستن با قطر mu;m 0.7، مقدار dna mu;g 1، فشار هلیوم شتاب‌دهنده psi 1100، فاصله شلیک 6 سانتی‌متر و دوره پیش‌تیمار 24 ساعت حاصل شد، و این پارامترها به عنوان دستورالعمل کارآمد تراریختی کلروپلاستی معرفی می‌شود. گیاهان هموپلاسم پس از سه دوره باززایی در حضور آنتی‌بیوتیک‌های استرپتو/اسپکتینومایسین بدست آمدند. تایید مولکولی درج کاست بیانی در محل دقیق ژنوم و تایید هموپلاسمی با استفاده از آنالیز pcr و لکه‌گذاری سادرن انجام شد. گیاهچه‌های سبز و آلبینوی حاصل از جوانه‌زنی بذور تولید شده از تلاقی متقابل بین گیاهان توتون شاهد و ترانسپلاستوم، توارث مادری ژن‌های انتقالی به کلروپلاست را تائید کرد.

Physical and Biologically Effective Parameters in Developing Transplastomic Tobacco Plants by Particle Bombardment Method using PDS-1000/He

Optimization of the effective parameters in the biolistic method for highperformance DNA transferring into the chloroplasts without tissue damage is a necessary requirement for developing transplastomic plants. Due to the relative similarity of the physical barriers at the entry of microcarriers into the nucleus and chloroplasts, the nuclear gus reporter gene is usually used, but the physical and biological parameters involved in plastid engineering have not been directly reported. In this study, to optimize gene transfer to tobacco chloroplasts, some parameters such as microcarrier type, DNA concentration, helium accelerating pressure, leaf arrangement and shooting distance, and pretreatment duration of explants before bombardment were investigated. After transferring the chloroplast #39;s vector to explants, regeneration of transplastomic plants was performed in a selection medium containing 500 mg/l spectinomycin. The highest number of transplastomic plants (2.5 plants per bombardment) was obtained with Tungsten particles with a diameter of 0.7 mu;m, with 1 mu;g DNA/shooting, accelerating helium pressure 1100 psi, shooting distance of 6 cm and 24h pretreatment period. Homoplasmic plants were obtained after three reregeneration periods at the presence of both strepto/spectinomycin antibiotics. Molecular confirmation of the correct insertion of expression cassette at the targeted place of the genome and the confirmation of homoplasmy were performed using PCR analysis and southern blotting. Maternal inheritance of the transferred genes into the chloroplasts was confirmed by green and albino seedlings resulted from seed germination, product of reciprocal crosses between control and transplastomic tobacco plants.