ایجاد دیرگلدهی در کاهو با استفاده از خاموشی ژن msi4 به کمک rna silencing

دیرگلدهی در کاهو باعث تولید برگهای زیاد و حفظ کیفیت خوراکی محصول آن می باشد. شروع زمان گلدهی در گیاهان پدیده ای است کاملا هدایت شده که به پارامترهای محیطی و درونی گیاه وابسته است و توسط شبکه تنظیمی ژنهای زیادی کنترل می‌شود. یکی از مشکلات در زمینه پرورش و عملکرد بالای محصولات زراعی و باغی عدم تطابق زمان گلدهی با شرایط مطلوب است. با افزایش جمعیت، تولید گیاهان کارا و با بیوماس بالاتر ضروری می‌باشد. در شبکه تنظیمی گلدهی، flowering locus c (flc)، یک فاکتور رونویسی، جعبه mads است که مانع از گلدهی می‌شود. مسیر خودمختار شروع گلدهی را به طور مستقل از طول روز، از طریق سرکوبی flc، تسریع می‌کند. ژن msi4/fve یک ژن کلیدی مسیر خودمختار است که در کنترل زمان تکثیر و تمایز آغازین سلول، رشد اندام و زمان گلدهی درگیر است و نقش کلیدی در تعیین زمان گلدهی دارد و توسط تغییرات اپی‌ژنتیکی موجب کاهش بیان ژن flc می‌گردد. هدف این تحقیق استفاده از تکنیک rna silencing برای مهار کردن ژن msi4 در سطح بعد از رونویسی در گیاه کاهو می باشد. برای بهینه کردن کشت بافت گیاه کاهو در محیط کشت ms از هورمونهای bap، کاینتین و naa و جهت باززایی مستقیم از ریزنمونه‌های کوتیلدون و برگ در مدت سه هفته استفاده شد و تیمار هورمونی 0.1 میلی‌گرم در لیتر naa و 0.01 میلی‌گرم در لیتر bap بیشترین باززایی را نشان داد. برای سنتز ساختار سنجاق‌سری مورد نیاز در تکنیک rna silencing، قطعه ای از انتهای ژن msi4 آرابیدوپسیس توسط pcr تکثیر و با دو همسانه سازی متوالی در دو جهت سنس و آنتی‌سنس درون وکتور خاموشی pfgc5941 قرار داده شد. آنگاه ساختار سنجاق‌سری در این وکتور نوترکیب به واسطه آگروباکتریوم به گیاه کاهو انتقال یافت. گیاهان تراریخته بدست آمده به منظور تائید حضور ژن انتقالی در آنها توسطpcr بررسی شد و مطالعه روی فنوتیپ گلدهی این گیاهان تراریخت نشان داد که خاموشی msi4 در کاهو باعث دیرگلدهی این گیاه (حدود یک و نیم ماه تاخیر) و تولید بیشتر برگ در آن می شود.

Delayed flowering in lettuce using MSI4 gene silencing by RNAi

Late flowering in lettuce produces additional leaves and maintains the edible quality of its product. Control of flowering time in plants is vital for plant fitness and for agricultural purposes and is an important factor in successful reproduction and seed crop yield and depends on the environmental and internal parameters of the plant and it is controlled by the regulatory network of genes. One of the problems in the field of crops and horticulture is the mismatch of flowering time with favorable environmental conditions. by increase in population, it is necessary to produce efficient plants with higher biomass. In the flowering regulatory network, Flowering Locus C (FLC), a MADS box transcription factor, prevents flowering. The autonomous pathway accelerates the onset of flowering independently of daylight by suppressing FLC. The MSI4/FVE gene is a key gene in the autonomous pathway. It is involved in controlling cell proliferation and early differentiation, organ growth and plays a key role in accelerating flowering by reducing the expression of FLC gene via epigenetic changes. in this study, using the RNA Silencing technique, MSI4/FVE gene expression was repressed at post transcriptional level. To this end, first, the tissue culture of lettuce in MS culture medium was optimized using BAP, Kinetin and NAA hormones for direct regeneration from cotyledon and leaf explants. The MS medium containing 0.1 mg/l NAA and 0.01 mg/l BAP has the highest regeneration rate for cotyledon explants. Then, for construction of silencing hairpin construct, a fragment of Arabidopsis thaliana MSI4 gene was amplified by PCR and then cloned in sense and in antisense directions into pFGC5941 vector by two consecutive cloning. The hairpin structure in this recombinant vector was then transferred to the lettuce plant by Agrobacterium. The obtained transgenic plants were tested by PCR to confirm the presence of the transgene and the study on the flowering phenotype of these transgenic plants showed that the silencing of MSI4 in lettuce caused the plant to flower late (about 1.5 months delay) and produce additional leaves.