خاموشی ژن bzip14 با استفاده از crispr/cas9 و بررسی موتانت ها در پاسخ به تنش شبکه آندوپلاسمی در گیاه marchantia polymorpha

انباشته شدن پروتئین‌های تانخورده و بدتاخورده سبب تنش شبکه آندوپلاسمی می‌شود. در پاسخ به تنش شبکه آندوپلاسمی، پاسخ به پروتئین تانخورده (upr) توسط حس‌گرهای تراغشایی شبکه آندوپلاسمی راه‌اندازی می‌شود. این مسیر مجموعه‌ای از سیگنال‌های پیام‌رسان یکپارچه است که برای بازگرداندن پایداری شبکه‌ آندوپلاسمی طراحی شده است. دو فاکتور رونویسی bzip به نام‌های bzip14‌ و bzip7 مسیر upr‌ را در گیاه marchantia polymorpha تنظیم می‌کنند. در این مطالعه لاین‌ّهای موتانت bzip14 با استفاده از فناوری crispr/cas9 در گیاه مارکانتیا جمع‌آوری شده است. بدین منظور توالی dna‌ ژن bzip14 در پایگاه اطلاعاتی marchantia.info به کمک blastp برای گیاه مارکانتیا شناسایی شد. بدین منظور، توالی dnaی ژن bzip14 با انجام بلاست پروتئینی در وبگاه marchantia.info شناسایی شد. توالی اگزون به منظور شناسایی sgrnaها در پایگاهhttp://crispor.tefor.net/ وارد و از میان sgrnaهای پیشنهادی، سه کاندید انتخاب شدند. sgrnaها درون سازه اختصاصی crispr/cas9 برای گیاه مارکانتیا به نام pmpge013 وارد و پس از انتقال به اگروباکتری سویه‌ gwb303+psoup به گیاه انتقال داده شد. از گیاهان باززا شده در محیط انتخابی دارای هایگرومایسین، استخراج dna انجام و پس از تکثیر با پرایمرهای اختصاصی، برای توالی‌یابی ارسال شد. هشت لاین از 11 لاین با توالی صحیح، تغییرات نوکلئوتیدی حذف و اضافه در توالی dna‌ نشان دادند. یک لاین موتانت انتخاب و برای ارزیابی فنوتیپی و آزمون زنده‌مانی به محیط حاوی ترکیب تونیکامایسین، ماده شیمیایی القا کننده تنش شبکه آندوپلاسمی انتقال یافت. بررسی‌ها نشان داد که bzip14‌ تنها هومولوگ ژن‌های bzip17 و bzip28 در گیاه آرابیدوپسیس است. همچنین تحت تنش شبکه آندوپلاسمی، گیاهان موتانت در مقایسه با گیاهان وحشی تفاوت معناداری در سطح 5 درصد نشان داده‌اند.

Knocking out bzip14 gene using CRISPR/Cas9 and analyzing the mutant line in response to induced ER stress in Marchantia polymorpha

Accumulation of unfolded and misfolded proteins cause ER stress. In response to ER stress, the unfolded protein response (UPR) is triggered by ER transmembrane sensor. UPR, a set of integrated signaling pathways, designed to restore ER homeostasis. Two bZIP transcriptional factors regulate the UPR pathway in Marchantia Polymorpha: bZIP14 and bZIP7. In this study, bzip14 mutant lines were generated using CRISPR/Cas9. In this order, the bZIP14 DNA sequence was identified by Blastp in Marchantia.info, a database website for M. polymorpha. Exons are implied to find out the proper sgRNAs as candidates in http://crispor.tefor.net/. Among all suggested sgRNAs, three of them were selected as candidates. sgRNAs were introduced into pMpGE013, a specific CRISPR/Cas9 vector in M. polymorpha. After transformation to agrobacteria GWB303+pSOUP, it was transformed into the plants. DNA was extracted from plants regenerated in selective media containing hygromycin, amplified using PCR by specific primers, and sent to sequencing. Eight out of 11 lines that were sequenced properly showed deletion and insertion in the DNA sequence. One mutant line was chosen for phenotypic assay and a survival test in the media containing tunicamycin, ER stress inducer. Our result showed that there are two isoforms of bZIP17 and bZIP28 in Arabidopsis thaliana, as homologs with bZIP14 in M. polymorpha. Also, a significant difference (pvalue le; 0.05) was observed between bzip14 mutant and wild type under ER stress conditions.