ایجاد سیستم شناسایی وجود کوفاکتور مولیبدئوم در باکتری escherichia coli

یکی از آنزیم های درگیر در تطبیق پذیری با شرایط مختلف محیطی، آنزیم بیوتین سولفوکساید ریداکتاز (bisc) است که علاوه بر توانایی تبدیل بیوتین سولفوکساید به بیوتین در شرایط اکسیداتیو، میتواند متیونین سولفوکساید را نیز به متیونین تبدیل کند. اسید آمینه متیونین چه بصورت آزاد و چه در زنجیره پروتئینی اهمیت بسیاری در فرایند سنتز پروتئین و فعالیت آن داراست. آنزیم بیوتین سولفوکساید ریداکتاز (bisc) برای فعال بودن وابسته به کوفاکتور باکتریایی mgdbis می باشد. در این مطالعه به منظور تایید فعال بودن کوفاکتور باکتریایی mgdbis روشی غیرمستقیم طراحی شد که در این روش از آنزیم باکتریایی بیوتین سولفوکساید (bisc) به عنوان ژن گزارشگر استفاده شد. در این راستا سازه ژنی biscpjet ساخته شد و شوک حرارتی به باکتری e.coli استرین mach1 منتقل شد. کلون های تشکیل شده در محیط lb جامد با آنتی بیوتیک آمپیسیلین 200 micro;g/ml انتخاب شدند و سپس واکنش pcr روی آنها صورت گرفت. پس از تایید نتایج توالی یابی کلون های مثبت، قطعه مورد نظر جدا و به ناقل بیانی petduet انتقال داده شد. کلون lrm;های حاوی ژن به باکتری میزبان rossetta منتقل شدند. فرابیان آنزیم bisc بر روی ژل pagesds مورد بررسی قرار گرفت و نیز فعالیت این آنزیم بصورت باند بی lrm;رنگ بر اثر اکسید شدن متیل وایولوژن روی ژل native مشاهده شد که نشان دهنده حضور فعال کوفاکتور mgdbis بود.

Establishment of molybdeum cofactor detection system in Escherichia coli

Biotin sulfoxide reductase enzyme is one of the enzymes involved in adaptation to different environmental conditions. BisC enzyme converts biotin sulfoxide to biotin and Methionine sulfoxide to Methionine under oxidative stress conditions. Both free Methionine and protein bound chains Methionine are essential in protein synthesis process and the function of proteins. The activity of the BisC enzyme is dependent to the BisMGD as a cofactor. In the current study, in order to verify the presence of bacterial Molybdeum cofactor, an indirect approach was made by showing the activity of BisC enzyme as a reporter gene. Therefore, in this regard BisC gene was cloned to pJet vector and was transferred to Mach1 strain of E. coli by heat shock transformation. The clones were selected on LB medium complemented with 200 micro;g/ml of Ampicillin antibiotic and the PCR reaction was done. After verifying of positive clones by sequencing, the BisC gene was digested and ligated to the pETDuet expression vector and transferred to Rossetta. Overexpression of BisC enzyme was analyzed on a SDSPAGE gel and the activity of the enzyme could be showed as a colorless band on the Native gel by oxidation of methyl viologen. It proved the presence of active BisMGD as a cofactor.