همسانه سازی و بیان هترولوگ لاکاز در pichia pastoris و تعیین خصوصیات بیوشیمیایی لاکاز نوترکیب

لاکازها آنزیم هایی حاوی مس می باشند که اکسیداسیون ترکیبات آروماتیک و غیرآروماتیک را از طریق احیای مولکول اکسیژن به آب کاتالیز می کنند . همچنین به دلیل قابلیت اکسیداسیون طیف وسیعی از ترکیبات فنلی کاربرد وسیعی در صنعت دارند. در این مطالعه توالی نوکلئوتیدی ژن لاکاز بر اساس ترجیح کدونی میزبان مخمری pichia pastoris gs115 بهینه شد، سپس توسط شرکت اینویتروژن سنتز و در حامل بیانی ppicz alpha a همسانه سازی شد و تحت پیشبر aox1 به مخمر پیکیا پاستوریس به روش الکتروپوریشن منتقل شد. به منظور تعیین شرایط بهینه بیش بیان آنزیم، در سطوح مختلفی از دما، غلظت مس و متانول القای بیان صورت گرفت و فعالیت آنزیم در هریک از سطوح ارزیابی شد. بیش بیان آنزیم در غلظت 0.4 میلی مولار مس و 0.8 درصد متانول و دمای 25 درجه سانتی گراد به دست آمد. بیش بیان ترشحی لاکاز در شرایط بهینه u/l 9600 به دست آمد. پس از بررسی کیفی و کمی آنزیم برخی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم تعیین شد. دما و ph بهینه لاکاز نوترکیب به ترتیب40 درجه سانتی گراد و 3 تعیین شد. بررسی پایداری دمایی و ph لاکاز نشان داد که این آنزیم پایداری بالایی در برابر حرارت داشته و قادر به فعالیت در طیف وسیعی از ph می باشد. بررسی خصوصیات کینتیکی آنزیم با استفاده از سوبسترای abts ، mm 0/089 =km تعیین شد. نتایج این تحقیق نشان داد که مخمر پیکیا پاستوریس می تواند کاندیدای مناسبی برای بیان لاکاز نوترکیب به منظور استفاده در صنایع متعدد جهت پاکسازی پساب، بیوسنسور و سایر کاربردها باشد.

Cloning and heterologous expression of Laccase in Pichia pastoris and determination of some biochemical properties

Laccase (EC 1.10.3.2) enzymes are multicopper oxidase which catalyze the oxidation of aromatic and non aromatic compounds with electron reduction of molecular oxygen to water. These enzymes catalyze the oxidation of a wide array of phenolic compound and have been used in different industrial field. In this study, Nucleotide sequence of laccase (accession number: AY081188.1) was optimized according to the codon preference of Pichia pastoris. Laccase gene was synthesized and cloned into pPICZalpha A. under control of AOX1 promoter then transformed to P. pastoris by electroporation. Methanol concentration, copper salts concentration and temperature were varied in order to enhance laccase expression in the heterologous system. Optimal fermentation condition for laccase production in shake flask cultivation using BMGY medium were obtained by presence of 0.4 mM Cu+2, at 25 °C culture temperature, by 0.8% methanol added into culture every 24 h. the volumetric activity was achieved 9600 U/L after 12day culture in fernbach flask. The biochemical properties of recombinant laccase and kinetic parameters were studied. The laccase activity was optimal at pH 3 and 40 °C. Its Km value was 0.089 mM for ABTS [2, 2 acute;azinobis (3ethylbenzthiazoline6sulphoric acid)]. The result of this study was showed that Pichia pastoris can be useful tool for heterologous laccase expression in order to use in industrial application such as wastewater treatment, biosensor etc.