همسانه سازی و بیان ژن پروتئین پوششی جدایه‌ ایرانی ویروس لکه برگی کلروتیک سیب (aclsv) در e. coli

ویروس لکه برگی کلروتیک سیب (apple chlorotic leaf spot virus, aclsv) یکی از ویروس های مهم درختان میوه دانه دار و هسته دار می باشد که گسترش جهانی دارد. هدف از این مطالعه، ساخت سازه بیانی و سپس بیان ژن پروتئین پوششی (coat protein (cp)) ویروس لکه برگی کلروتیک سیب در باکتری escherichia coli می باشد. بیان پروتئین پوششی در سیستم پروکاریوتی، نیاز به خالص‌سازی ویروس از گیاه میزبان را که مستلزم وجود اولتراسانتریفوژ است، مرتفع می‌سازد. به منظور تولید پروتئین پوششی نوترکیب، جدایه ssa از میزبان سیب جداسازی و با آغازگرهای اختصاصیaclsv-mf وaclsv-mr ژن کامل پروتئین پوششی به طول 582 جفت باز تکثیر شد. ژن کامل cp به حامل همسانه‌سازی ptg19 متصل‌ و به باکتری e. coli سویه dh5α منتقل شد. باکتری‌های تراریخت شده با پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت lb حاوی آمپی‌سیلین، x-gal و iptg غربال و به روش تجزیه قلیایی استخراج گردیدند. این ژن در پلاسمید استخراج شده با آنزیم‌های bamhi و xhoiکه محل اثر آنها در آغازگرها قرار داده شده بودند، برش و به حامل بیان pet28a(+) که با همین دو آنزیم برش داده شده بودند، اتصال داده شد. pet28a (+) حاوی ژن cp ویروس در باکتری e. coli سویه bl21(de3) ترانسفورم و سپس القاء بیان cp با اضافه نمودن iptg در غلظت نهایی 1mm پس از چهار ساعت در الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید حاوی سدیم دودسیل سولفات (sds-page) بررسی شد. نتایج حاصل از sds-page حاکی از بیان پروتئین حدود 26 کیلودالتونی مربوط به ژن پروتئین پوششی ویروس مذکور بود. بیان این پروتئین می تواند برای تولید آنتی بادی بر علیه aclsv مورد استفاده قرار گیرد.

Cloning and expression of Iranian isolate of Apple chlorotic leaf spot virus coat protein gene in E. coli

The Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV) is among of the most common virus infecting pome and stone fruit trees around the world. The virus has spread throughout the world and has been reported in many hosts such as; apples, pears, peaches and cherries. The purpose of this study is to express the coat protein (CP) of ACLSV in E. coli. CP expression in E. coli has been developed to prepare antigen for antibody production without needs to purify the virus from infected plant. In this study, complete CP gene (582 bp) from an isolate of ACLSV (SSa) was amplified by specific primers, MF and MR. The amplified CP gene was ligated to TA cloning vector (pTG19ACLSV CP) and transformed into E. coli strain DH5 alpha;. Transformed cells were selected on LB containing ampicillin, XGal and IPTG, and recombinant plasmids were confirmed by restriction analysis. Then, the pTGACLSV CP was subcloned into pET28a (+) as expression vector that digested by BamHl and XhoI restriction enzymes. Finally, the pET28aACLSV CP was transformed into E. coli strain BL21 by heat shock method. For ACLSV CP expression, the cells containing pET28aACLSV CP were induced by 1 mM of IPTG and the protein was extracted two and four hours after induction and analyzed in SDSPAGE. The SDSPAGE result showed that ACLSV CP have been expressed that is expected based on additional tags from plasmid.