اثرات آنتی ‌اکسیدانی کورکومین بر فراسنجه‌های جنبایی، ساختاری و بیوشیمیایی اسپرم اپیدیدیمی قوچ نژاد شال پس از فرآیند انجماد - یخ ‎گشایی

مقدمه و هدف: در برنامه‌های تولید مثلی دام و طیور تکنیک تلقیح مصنوعی به‌عنوان یک تکنیک پایه کابرد فراوانی دارد. لازمه استفاده از این تکنیک، انجماد اسپرم می‎باشد. انجماد اسپرم فرآیندی است که طی آن ژن‌های برتر به‌طور وسیعی گسترش یافته و می‌توان از یک دام نر با خصوصیات ژنتیکی بالا به تعداد نتاج بیشتری دست پیدا کرد. اما طی فرآیند سردسازی و انجماد، در اثر افت دما و شوک سرما و به‌دنبال آن تولید بیش از حد رادیکال‎های آزاد، آسیب‎های زیادی به اسپرم وارد می‎شود. پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم (lpo) در نتیجه تولید گونه‌های اکسیژن فعال (ros) رخ می‎دهد که به ساختار غشای اسپرم آسیب می‎رساند. حمله رادیکال‌های آزاد به اندامک‌های داخل سلولی به‌خصوص میتوکندری و dna اسپرم می‌تواند اغلب عملکردهای اسپرم را مختل کرده و تاثیر بسیار منفی بر باروری اسپرم‌ها داشته باشد. از این‌رو افزودن ترکیبات آنتی‌اکسیدانی به رقیق‌کننده اسپرم یک امر ضروری جهت انجماد و حفظ کیفیت اسپرم‌ها محسوب می‌شود. کورکومین به‌عنوان یک ترکیب آنتی‌اکسیدانی طبیعی حاصل از ریشه زردچوبه با ویژگی داشتن حلقه فنلی و بخش بتا دی-‌ کتونی در ساختمان خود قادر به خنثی‌سازی رادیکال‌های آزاد و در نتیجه حفظ کیفیت سلول‌های اسپرم می‌باشد. این ترکیب در اغلب مطالعات دارویی، پزشکی و صنایع غذایی به‌عنوان یک ترکیب آنتی‌اکسیدانی بسیار قوی معرفی شده و حتی در برخی مطالعات، هم‌پایه ترکیبات آنتی‌اکسیدانی شناخته شده مانند ویتامین‌های e و c و آنزیم سوپر‌اکسید دیسموتاز گزارش شده است. هدف از این آزمایش، بررسی اثرات افزودن سطوح مختلف کورکومین به رقیق‌کننده‌ها بر فراسنجه‌های جنبایی، ساختاری و بیوشیمیایی (تنش اکسیداتیو) اسپرم اپیدیدمی قوچ پس از فرآیند انجماد- یخ‎گشایی بود. مواد و روش‌ها: در این آزمایش بافت بیضه از کشتارگاه جمع‌آوری و به آزمایشگاه منتقل شد و با برش دم اپیدیدیم سلول‌های اسپرم جمع‌آوری شد. نمونه‌های اسپرم پس از ارزیابی اولیه انتخاب و در رقیق‌کننده بر پایه تریس- زرده تخم‌مرغ با غلظت 50 میلیون اسپرم در هر میلی‌لیتر رقیق شدند. در دمای 37 درجه سانتی‌گراد غلظت‌های مختلف کورکومین شامل 0، 10، 25 و 50 میکرومولار به رقیق‌کننده حاوی اسپرم اضافه شد. نمونه‌های حاوی غلظت‌های مختلف کورکومین در گروه‌های آزمایشی مختلف در فالکون 15 میلی‌لیتری ریخته و در داخل آب هم‌دما به دمای 5 درجه سانتی‌گراد برای سردسازی منتقل شدند. پس از حدود دو ساعت نمونه‌ها در این دما به تعادل رسیدند. سپس گروه‌های آزمایشی در همان دما در پایوت‌های یک چهارم هم‌دما پر شده و مهر و موم شدند. پایوت‌ها در فاصله چهار سانتی‌متری از سطح ازت مایع به‌وسیله بخار ازت به‌مدت هفت دقیقه منجمد شده و سپس در داخل ازت مایع غوطه‌ور شدند. پایوت‌های منجمد شده تا زمان ارزیابی (حدود یک ماه) در داخل تانک ازت نگهداری شدند. پس از یخ‎گشایی در دمای 37 درجه سانتی‎گراد به‎مدت 30 ثانیه، فراسنجه‌های جنبایی، زنده‌مانی و وضعیت آپوپتوزیس، سلامت غشای پلاسمایی، درصد ناهنجاری‌ها، فراسنجه‌های بیوشیمیایی شامل سنجش غلظت مالون دی‎آلدهید (mda)، فعالیت آنزیم‌های سوپر اکسید دیسموتاز (sod)، گلوتاتیون پراکسیداز (gpx)، کاتالاز (cat) و سنجش غلظت h202 ارزیابی شدند. داده‌های حاصل از ارزیابی‌ها توسط نرم‎افزار sas و رویه glm در سطح معنی‌داری 0/05 واکاوی شدند. یافته‌ها: نتایج این آزمایش نشان داد که در مورد فراسنجه‌های جنبایی مانند جنبایی کلی (tm) رقیق‌کننده حاوی 10 و 25 میکرومولار کورکومین، جنبایی پیش‌‌رونده (pm) رقیق‌کننده حاوی هر سه غلظت کورکومین (10، 25 و 50 میکرومولار) و سرعت در مسیر میانگین (vcl) رقیق‌کننده حاوی 25 میکرومولار کورکومین به‌طور معنی‌داری نسبت به گروه شاهد عملکرد بهتری داشتند (0/05p<). اما برای سایر فراسنجه‌های جنبایی مانند سرعت در مسیر منحنی (vap)، سرعت در مسیر مستقیم (vsl)، حرکت عرضی سر (alh)، خطی بودن جنبایی (lin) و درصد حرکت مستقیم (str) بین گروه‌های آزمایشی تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد (0/05p>). در بررسی فراسنجه‌های ساختاری مشخص شد که رقیق‌کننده حاوی هر سه سطوح کورکومین (10، 25 و 50 میکرومولار) درصد سلامت غشای پلاسمایی اسپرم را پس از یخ‌گشایی به‌طور معنی‌داری افزایش داده بود و در مورد درصد زنده‌مانی، رقیق‌کننده حاوی 25 میکرومولار کورکومین به‌طور معنی‌داری نسبت به سایر گروه‌های تیماری عملکرد بهتری داشت و افزودن همین سطح درصد آپوپتوزیس اولیه را نسبت به سایر گروه‌ها به‌طور معنی‌داری کاهش داد (0/05>p). در مورد صفات درصد آپوپتوزیس ثانویه، نکروز و ناهنجاری‌ها در میان تیمارها تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد (0/05p>). نتایج ارزیابی فراسنجه‌های بیوشیمیایی (تنش اکسیداتیو) نشان داد که غلظت mda و فعالیت آنزیم cat در میان گروه‌های آزمایشی تفاوت معنی‌داری ندارد (0/05p>)، ولی در مورد فعالیت آنزیم sod رقیق‌کننده حاوی 10 و 25 میکرومولار کورکومین و برای gpx رقیق‌کننده حاوی 25 میکرومولار کورکومین به‌طور‌ معنی‌داری موجب افزایش فعالیت این آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی شد (0/05>p). همچنین افزودن هر سه غلظت کورکومین (10، 25 و 50 میکرومولار) غلظت h202 را به‌طور معنی‌داری نسبت به گروه شاهد کاهش داد (0/05p<). نتیجه‌گیری: نتایج این آزمایش نشان داد که استفاده از کورکومین در رقیق‌کننده انجمادی می‌تواند موجب بهبود کیفیت اسپرم اپیدیدمی قوچ پس از فرآیند انجماد- یخ گشایی شود. از این‌رو استفاده از غلظت 25 میکرومولار کورکومین در رقیق‌کننده انجمادی توصیه می‌شود. 

antioxidant effects of curcumin on the motility and structural and biochemical parameters of epididymal sperm in shal rams after the freezing-thawing process

background: artificial insemination is widely used as a basic technique in livestock and poultry breeding programs. the use of this technique requires sperm freezing, a process during which superior genes are widely expanded and more progeny can be obtained from a male animal with high genetic characteristics. however, sperm undergoes much damage during the cooling and freezing process due to the drop in temperature and cold shock and the subsequent excessive production of free radicals. lipid peroxidation (lpo) of the sperm plasma membrane occurs due to the production of reactive oxygen species (ros), which damages the structure of the sperm membrane. the attack of free radicals on intracellular organelles, especially mitochondria and sperm dna, can often disrupt sperm functions and have a very negative effect on sperm fertility. therefore, adding antioxidant compounds to sperm thinners is considered essential for freezing and maintaining sperm quality. curcumin, as a natural antioxidant compound obtained from turmeric root, with the characteristic of having a phenolic ring and a beta-di-ketone part in its structure, is capable of neutralizing free radicals and thus maintaining the quality of sperm cells. this compound has been introduced as a very strong antioxidant compound in most pharmaceutical, medical, and food industry studies, and even in some studies, it has been reported to be the co-base of known antioxidant compounds, such as vitamins e and c, and the superoxide dismutase enzyme. this experiment aimed to investigate the effects of adding different levels of curcumin to diluents on the physical, structural, and biochemical parameters (oxidative stress) of ram epididymal sperm after the freezing-thawing process.methods: in this experiment, testicular tissue was collected from a slaughterhouse and transferred to the laboratory. sperm cells were collected by cutting the tail of the epididymis. sperm samples were selected after an initial evaluation and diluted in a tris-egg yolk-based diluent with a concentration of 50 million sperm per milliliter. different concentrations of curcumin, including 0, 10, 25, and 50 μm, were added to the sperm-containing diluent at 37 °c. samples containing different concentrations of curcumin in different experimental groups were poured into a 15 ml falcon and transferred to 5 °c in isothermal water for cooling. after about 2 hours, the samples reached equilibrium at this temperature. then, the experimental groups were filled and sealed at the same temperature in one-quarter straws at the same temperature. the peyotes were frozen at a distance of 4 cm from the surface of liquid nitrogen by nitrogen vapor for 7 minutes and then immersed in liquid nitrogen. the frozen peyotes were kept in a nitrogen tank until the evaluation (about 1 month). physical parameters, survival, apoptosis status, plasma membrane health, abnormality percentage, biochemical parameters (including measurement of malondialdehyde (mda) concentration, activity of superoxide dismutase enzymes (sod), glutathione peroxidase (gpx), and catalase (cat), and h2o2 concentration assay were evaluated after thawing at 37 °c for 30 seconds. the data obtained from the evaluations were analyzed by sas software and the glm procedure at a significance level of 0.05.