شناسایی واریانت‎ های ژنتیکی مبتنی بر چند شکلی تک نوکلئوتیدی و رخداد حذف-اضافه در ژن ‎های tlr8 ،irf10b و gapdh مرتبط با سیستم ایمنی در ماهی قزل ‎آلای رنگین‎ کمان با استفاده از داده ‎های ترانسکریپتومی

مقدمه و هدف: سپتی سمی هموراژیک ویروسی (vhs) یکی از شایع‎ترین بیماری‎های ویروسی در صنعت پرورش ماهی قزل‎آلا رنگین‎کمان است که باعث خسارات اقتصادی سنگین می‎شود. اهمیت ماهی قزل‎آلای رنگین‎کمان در صنعت آبزی‎پروری ایران از یک سو و افزایش تلفات ناشی از شیوع بیماری‎های عفونی از سوی دیگر نیاز به شناخت بیشتر سیستم ایمنی ماهیان و همچنین دست‎یابی به ابزاری جهت تشخیص دقیق عوامل ایجاد بیماری‎های این‎گونه از ماهیان را مشخص می‎سازد. کنترل و پیشگیری از شیوع بیماری‎ها در ماهیان پرورشی مستلزم اجرای یک برنامه منظم تشخیص و درمان می‎باشد که در این رابطه نشانگرهای مولکولی می‎توانند به‎عنوان یک ابزار پایش و تشخیص مفید باشند. مطالعات اخیر نشان داد که رویکردهای محاسباتی برای شناسایی واریانت‎های rna توالی‎یابی شده، از روش‎های بسیار کارآمد و مقرون به‎صرفه جهت ردیابی تنوع ژنومیکی هستند. برخی از واریانت‎های مبتنی بر چند شکلی تک نوکلئوتیدی (snp)، از جمله مترادف، غیر مترادف و غیر کد شونده و همچنین رخداد حذف-اضافه (indel) ناشی از داده‎های rna توالی‎یابی شده می‎توانند به‎عنوان یک نشانگر ژنتیکی مطلوب در آنالیزهای تفرق ژنتیکی به‎ویژه در بررسی بیان اختصاصی آلل‎ها مورد استفاده قرار گیرند. هدف از مطالعه حاضر شناسایی واریانت‎های ژنتیکی مبتنی بر snp و رخداد حذف-اضافه با استفاده از داده‎های ترانسکریپتومی در برخی از ژن‎های بیان شده در ماهی قزل‎آلای رنگین‎کمان تیمار شده با ویروس vhsv بود. مواد و روش‌ها: در این تحقیق از داده‎های حاصل از توالی‎یابیrna  از بافت‌ طحال ماهی قزل‎آلای رنگین‎کمان تیمار شده با ویروس vhsv استفاده شد. کنترل کیفی و هم‎ردیفی خوانش‎ها به‎ترتیب با استفاده از نرم‎افزارهای fastqc و star انجام شد. برای شناساییsnp ‎ها و indel‎ها از مجموعه‎ای از ابزارهای بیوانفورماتیکی(gatk)  استفاده شد. واریانت‎ها در مرحله نخست با استفاده ازgtak haplotypecaller  شناسایی و در مرحله بعد برای افزایش دقت و فیلترینگ snpهای شناسایی شده اولیه، از ابزار gtak variant filtration استفاده شد. پس از فیلترینگ، واریانت‎های شناسایی شده با استفاده از نرم‎افزار snpeff حاشیه‎نویسی و تعیین هویت شدند. در مرحله پایانی با استفاده از نرم‎افزار string ژن‎های مرتبط با سه ژن اصلی tlr8، irf10 و gapdh شناسایی و شبکه ژنی برمبنای این سه ژن ترسیم و ژن gapdh به‎عنوان ژن اصلی در نظر گرفته شد. یافته‌ها: در این تحقیق واریانت‎های ژنومیکی از نوع چندشکلی تک نوکلئوتیدی و رخداد حذف –اضافه در سه ژن tlr8،  irf10b و gapdh که از ژن های مرتبط با سیستم ایمنی هستند در ماهی قزل آلای رنگین برای اولین بار شناسایی و گزارش شدند. در این پژوهش تعداد 72snp  و 15 indel در ژن tlr8، 20snp  و 3 indel در ژن irf10 و 21 snp و 8 indel در ژن gapdh شناسایی شد. در جایگاه ژنی tlr8، به‎ترتیب 9/7 و 2/8 درصد از واریانت‎های snp در بالادست و پائین‎دست این ژن و نیز رخداد insdel برابر با 26/7 درصد در بالادست و 26/7 درصد در پائین‎دست این ژن شناسایی شدند. در جایگاه ژنی irf10 به‎ترتیب 10 و 65 درصد از واریانت‎های snp در بالا دست و پائین دست و تنها 33/3 درصد از رخداد insdel در پائین‎دست این ژن شناسایی شدند. در جایگاه ژنی gapdh هریک از واریانت‎های snp و insdel به‎ترتیب برابر با 47/6 و 12/5 درصد تنها در پائین‎دست این ژن شناسایی شدند. هیچ‎یک از این نوع واریانت‎ها در بالادست جایگاه ژنی gapdh شناسایی نشده است.  نتیجه‌گیری: از کارهای تحقیقاتی ضروری در رمزگشایی نقشه‎های فنوتیپی و ژنوتیپی در دام‎های اهلی، شناسایی آلل‎های خاص در تنطیم بیان ژن‎هاست. در این راستا اولین گام، ردیابی واریانت‎های ژنومیکی در ژن‎های بیان شده است. آنالیز نتایج این تحقیق نشان داد که موقعیت مکانی، نوع و وفور واریانت‎های ژنتیکی در هریک از جایگاه‎های نشانگر مورد مطالعه متفاوت بودند. با توجه به شناسایی واریانت‎های مبتنی بر snp و رخداد indel در سه ژن tlr8، irf10b و gapdh می‎توان از این یافته‎ها در برنامه‎های اصلاح نژادی با استفاده از روش انتخاب به‎کمک نشانگر در برابر عفونت‎های ویروسی از جمله vhs و همچنین در طراحی اسنیپ چیپ‎ها در گونه ماهی استفاده نمود. از آنجایی‎که واریانت‎های مختلف شناسایی شده در هریک از جایگاه‎های نشانگری مورد مطالعه نقش تنظیمی در بیان ژن‎ها دارند، فلذا بررسی تاثیر هریک از آن‎ها در بیان اختصاصی آلل‎ها بسیار حائز اهمیت است. همچنین با داشتن اطلاعات ژن‎های درگیر در سیستم ایمنی و با شناسایی نشانگرهای مولکولی مرتبط به این جایگاه‎ها و از طرفی مطالعه همبستگی بین این جایگاه‎ها با صفات کمی می‎توان از آن‎ها در طراحی برنامه‎های اصلاح نژاد در صنعت پرورش ماهی برای تولید سویه‎های مقاوم در مقابل بیماری‎ها بهره برد.  

identification of genetic variants based on single nucleotide polymorphisms and insertion-deletion events in tlr8, irf10b, and gapdh genes related to the immune system in rainbow trout using transcriptomic data

background: viral hemorrhagic septicemia (vhs) is one of the most common viral diseases in the rainbow salmon farming industry, which causes heavy economic losses. rainbow trout’s importance in the iranian aquaculture industry, on the one hand, and the increase in deaths due to the spread of infectious diseases, on the other hand, highlight the need for further understanding of the fish immune system and obtaining a tool to accurately diagnose the causes of diseases in this fish species. the control and prevention of disease outbreaks in farmed fish requires the implementation of a regular diagnosis and treatment program, for which molecular markers can be useful as a monitoring and diagnostic tool. recent studies have shown that computational approaches to identify sequenced rna variants are very efficient and cost-effective methods for tracking genomic diversity. some variants based on single nucleotide polymorphisms (snps), including synonymous, non-synonymous, and non-coding, as well as insertion-deletion (indel) events resulting in rna sequencing data, can be used as a desirable genetic marker in genetic differentiation analysis, especially in investigating allele-specific expression. the present study aimed to identify genetic variants based on snp and indel occurrence using transcriptomic data in some genes expressed in rainbow trout treated with the vhs virus.methods: rna sequencing data from the spleen tissue of rainbow trout treated with the vhs virus was used in this research. quality control and alignment of readings were done using fastqc and star software, respectively. a set of bioinformatics tools (gatk) was used to identify snps and indels. variants were identified in the first step using gtak haplotypecaller, and the gtak variant filtration tool was used in the next step to increase the accuracy and filtering of the initially identified snps. after filtering, the detected variants were annotated and identified using snpeff software. in the final step, the genes related to the three main genes (tlr8, irf10, and gapdh) were identified using string software, and the gene network was drawn based on these three genes. the gapdh gene was considered the main gene.results: in this research, genomic variants of snps and indel events in three tlr8, irf10b, and gapdh genes, which are related to the immune system, were identified and reported in rainbow trout for the first time. in total, 72 snps and 15 indels in the tlr8 gene, 20 snps and 3 indels in the irf10 gene, and 21 snps and 8 indels in the gapdh gene were identified in this study. in the tlr8 gene locus, 9.7 and 2.8% of snp variants were detected upstream and downstream of this gene, respectively, and the occurrence of indel was equal to 26.7%, which was detected in both upstream and downstream of this gene. in the irf10 gene locus, 10 and 65% of snp variants were detected upstream and downstream, respectively, and only 33.3% of indel events were detected downstream of this gene. in the gapdh downstream gene position, each of the snp and insdel variants was detected with frequencies equal to 47.6% and 12.5%, respectively, only in the downstream site of this gene. none of these types of variants were identified in the upstream site of the gapdh gene.