شناسایی چند شکلی های ژن Hsp70a1a در گوسفندان نژاد مهربان و رومانف با تکنیک Pcr-Sscp

در اقلیم های مختلف، نقش مقاومت سلولی به استرس های ناشی از تغییر دما از طریق خانواده ای از پروتئین ها که اصطلاحاً، پروتئین های شوک گرمایی (hsp) نامیده می شوند، کنترل می شود. در پژوهش حاضر، شناسایی چند شکلی های تک نوکلئوتیدی موجود در مناطقی از ژن hsp70a1a در گوسفند بومی نژاد مهربان و گوسفند وارداتی نژاد رومانف به جهت ویژگی این نژادها به سازگاری در اقلیم های سردسیری، بررسی شدند. در مجموع، تعداد 141 حیوان شامل گوسفند نژاد مهربان (100 راس) و گوسفند نژاد رومانف (41 راس)، به طور تصادفی انتخاب و مراحل خونگیری و استخراج dna طبق دستورالعمل های متداول انجام شد. سپس، واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) جهت تکثیر اگزون ژن hsp70a1a (oar_v4.0; chr20, nc_019477.2) به اندازه 247 و 298 جفت باز انجام شد. همچنین، جهت تعیین چند شکلی نمونه ها از تکنیک pcrsscp و متعاقب آن، توالی یابی مبتنی بر سانگر استفاده شد. بر اساس نتایج sscp، به طور مشابه در هر دو نژاد مهربان و رومانف تعداد 5 الگوی باندی مشاهده شد که قطعات تکثیر شده 247 و 298 جفت بازی به ترتیب دو و سه الگوی الکتروفوزی را دارا بودند. علاوه بر این، هیچ تفاوتی در فراوانی الگوهای مشاهده شده بین این دو نژاد گوسفند یافت نشد. همچنین، در این نژادها نتایج توالی یابی وجود تعداد 5 چند شکلی تک نوکلئوتیدی (snp) شامل g.26562252c>a، g.26562261g>c، g.26562270t>c، g.26562273c>t و g.26562279c>t در قطعه 247 جفت بازی و تعداد سه چند شکلی تک نوکلئوتیدی شامل g.26561745t>c، g.26561784c>t و g.26561877g>a در قطعه 298 جفت بازی شناسایی نمود. در مجموع، نتایج نشان داد که، همه چند شکلی ها به غیر ازg.26561745t>c و g.26561877g>a به طور معنی داری خارج از تعادل هاردی واینبرگ هستند (p<0/05). به عنوان نتیجه گیری نهایی، با توجه به نقش پروتئین های شوک دمایی در مقاومت به استرس های محیطی، شناسایی این چند شکلی ها می تواند تاثیر بسزایی در درک مکانیسم سازگاری به تحمل دمایی در نژادهای گوسفندان بومی ایرانی داشته باشد.

Identification of Polymorphism in HSP70A1A Gene in Mehraban and Romanov Sheep Breeds using PCR-SSCP Technique

The heat shock proteins (HSPs) are a family of proteins contributing to cellular resistance against a variety of thermal stresses in different climates. In this study we aimed to characterize polymorphisms of the ovine HSP70A1A gene in Mehraban indigenous sheep breed and Romanov imported sheep breed, because they are well adapted to the cold climate. Blood samples were collected from a total of 141 sheep (100 Mehraban and 41 Romanov), and then genomic DNA was extracted according to conventional instructions. Polymerase chain reaction (PCR) was performed to amplify the 247 bp and 298 bp of the exon region of the HSP70A1A gene (Oar_v4.0; Chr 20, NC_019477.2). Also, polymorphisms of the studied fragments were explored using single strand conformational polymorphism (SSCP) technique and then the amplified DNA fragments were sequenced by Sanger sequencing method. In both Mehraban and Romanov breeds, five distinct SSCP patterns were identified that two and three electrophoretic patterns were respectively related to 247 bp segment and 298 bp segments. Furthermore, frequencies of SSCP patterns showed no differences between breeds. Five single nucleotide polymorphisms (SNPs) including g.26562252C>A, g.26562261G>C, g.26562270T>C, g.26562273C>T and g.26562279C>T were identified in 247 bp segment, and also, three SNPs including g.26561745T>C, g.26561784C>T and g.26561877G>A were identified in 298 bp segment of PCR products. Results revealed that all SNPs were in Hardy -Weinberg disequilibrium (p < 0.05), except of g.26561745T>C and g.26561877G>A. Considering the role of HSPs in resistance to the environmental stresses, it can be conclude that the identification of these SNPs can play an important role on understanding the mechanism of adaptation to temperature tolerance among the Iranian indigenous sheep breeds.