Transient Expression of Ctb-Exend in Fused Genes in Nicotiana Tabacum Via Agrobacterium Tumefaciens

Exendin-4 is a human glucagon-like peptide-1 (glp-1) analogue, resistant to dipeptidyl peptidase (dpp), which activates the glp-1 receptor, increases insulin secretion, and improves glycemic control. in this study, exendin-4 (ex4) was fused to cholera toxin b subunit (ctb) and transiently expressed in tobacco leaves. the sequence of the ex4 fused to ctb subunit gene, with bamhi and saci restriction enzymes sites at the beginning of ctb and at the end of ex4 gene. after codon optimization, the sequence was synthesized and cloned in puc57 plasmid. the recombinant vectors were transformed into escherichia coli strain dh5α. the puc57-ctb-ex4 construct was digested with bamhi and saci restriction enzymes, cloned into pbi121 expression binary vector, and transferred into tobacco leaves through agroinfiltration. transcription of the ex4 fused to cholera toxin b subunit gene in leaves was confirmed by rt-pcr analysis. after agroinfiltration, the protein was extracted from treated leaves, and elisa test was performed using anti-ctb antibody. the production of recombinant protein was approved by elisa test in transformed leaves.

بیان موقت ژن اکسندین-4 متصل به زیر واحدBسم وبا (CTB) توسط آگروباکتریوم در تنباکو (Nicotiana tabacum)

اکسندین4 آنالوگ GLP1 انسانی می‌باشد که مقاوم به آنزیم دی پپتیدیل پپتیداز IV است و ترشح انسولین را افزایش داده که منجر به بهبود کنترل قند خون می شود. در این مطالعه، اکسندین4 جدا‌سازی شده از بزاق مارمولک، که آگونیست GLP1 می‌باشد، به‌عنوان یک پروتئین متصل شده به زیر‌واحد B سم وبا، به‌طور موقت در گیاه تنباکو بیان شد. ابتدا توالی ژن اکسندین4 متصل به زیر‌واحد B سم وبا طراحی و جایگاه‌های برش آنزیمی Bam HI وSacI به‌ترتیب در ابتدا زیر‌واحد B سم وبا و در انتهای توالی ژن اکسندین4 قرار داده شد و سپس توالی طراحی شده سنتز گردید. ژن اکسندین4 متصل به زیر‌واحد B سم وبا همسانه‌سازی شده در داخل ناقل کلونینگPUC57 ، به باکتری اشرشیاکلی منتقل گردید. سپس پلاسمید pUC57CTBEX4 استخراج شده از باکتری اشرشیاکلی، با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده Bam HI وSacI برش داده شد و در ناقل دوتایی بیانی pBI121 همسانه‌سازی گردید و از طریق آگرواینفیلتراسیون به برگ گیاه تنباکو انتقال یافت. رونویسی ژن اکسندین4 متصل به زیر‌واحد B سم وبا، به‌روش RTPCR در برگ گیاه تنباکو تایید گردید. از برگ‌های آگرواینفیلتره شده، پروتئین کل استخراج گردید و با استفاده از آنتی بادی ضد زیر‌واحد B سم وبا، آزمون الایزا صورت گرفت و تولید پروتئین نوترکیب تایید گردید.